張娟娟，傅 翔，朱全剛，張立超

(1.上海市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，上海 200071；2.上海市浦東新區(qū)新場(chǎng)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 201314；3.上海市控江醫(yī)院藥劑科，上海200093；4.上海市皮膚病醫(yī)院藥劑科，上海200443)

微針是一種高效、安全、新型的經(jīng)皮促透技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于皮膚美容、局部麻醉、免疫接種、蛋白質(zhì)和多肽類給藥、DNA 給藥等多個(gè)領(lǐng)域[1]。課題組前期將美容行業(yè)已使用多年的滾輪微針引入至醋酸曲安奈德的瘢痕裸鼠模型行皮膚治療，其無痛、均勻、便捷、可用于大張皮給藥等特點(diǎn)，有針對(duì)性地克服了瘢痕皮內(nèi)注射給藥存在的諸多缺點(diǎn)[2]。為解決市售滾輪微針無法控制力度均勻性、給藥重現(xiàn)性差等問題，課題組又改裝了市售滾輪微針并進(jìn)行了性能評(píng)價(jià)[3]。

目前國內(nèi)外均未見滾輪微針處理方法和處理次數(shù)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，不同文獻(xiàn)處理方法各異，分為單方向處理、垂直方向處理和垂直交叉4個(gè)方向處理，處理次數(shù)一般在50次以下。Zhou等[4]使用滾輪微針垂直方向各滾動(dòng)10次用于糖尿病大鼠的胰島素促透給藥；Yoon等[5]單方向處理50次；Badran等[6]則使用滾輪微針垂直交叉4個(gè)方向各3次；You等[7]單方向和4個(gè)交叉方向使用1、3、6、9次，并證明了4個(gè)交叉方向滾輪微針處理較單方向促透效果好。而用于美容的市售滾輪微針說明書則顯示，其處理方法是垂直交叉4個(gè)方向各10次。為此，課題組采用垂直交叉4個(gè)方向處理，以藥物滲透效果、分布均勻性和皮膚刺激性為指標(biāo)，評(píng)價(jià)滾輪微針在維A酸裸鼠皮膚促透中安全、有效的滾輪微針處理次數(shù)。

1 儀器、試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

滾輪微針(540針，針長500 μm，美國Clinical Resolution Laboratory)；SPD-10AVP高效液相色譜儀(日本島津公司)；Franz擴(kuò)散池(中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)所)；FluoView FV1000激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)；TEWL測(cè)量儀(芬蘭Delfin公司)；Powerlab/8sp激光多普勒血流儀(澳大利亞AD Instruments公司)；Canon 70D數(shù)碼相機(jī)(日本佳能公司)；TGL-18B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；萬分之一電子分析天平(上海精科天平)。

維A酸對(duì)照品(99.4%，批號(hào)：100307-200902，中國食品藥品檢定研究院)；維A酸乳膏(0.025%，批號(hào)：1204091，南京臣功制藥股份有限公司)；亞甲基藍(lán)(上海研域化學(xué)試劑有限公司)；龍膽紫(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)；FITC(北京Solarbio科技有限公司)；甲醇、異丙醇為色譜純；冰乙酸、乙醇、三乙醇胺、戊巴比妥鈉等其他試劑均為分析純。

BALB/c裸鼠(6～8周，雄性，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司/中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 維A酸的含量測(cè)定

參見文獻(xiàn)[8]。

2.2 體外滲透實(shí)驗(yàn)

2.2.1離體皮膚的處理

裸鼠拉頸處死后取下背部皮膚，去除皮下脂肪組織，用生理鹽水漂洗干凈，-20 ℃保存，2周內(nèi)使用。

2.2.2透皮接收液的制備

對(duì)照組皮膚不用微針處理，實(shí)驗(yàn)組皮膚置于電子天平的托盤上，用540針滾輪微針沿4個(gè)交叉方向處理(滾動(dòng)方向見文獻(xiàn)[8])，分別處理1、3、5、8、10次，控制力度為350～400 g(力度控制方法見文獻(xiàn)[3])。分別將對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮膚的角質(zhì)層朝上，固定于Franz擴(kuò)散池的給藥室與接收室之間。將0.3 g維A酸乳膏涂抹于鼠皮角質(zhì)層上(有效面積為0.85 cm2)，向接收室中加入接收液異丙醇-生理鹽水(1∶1)直至與皮膚緊密接觸，排除氣泡，置于(37.0±0.5)℃恒溫水浴中，以300 r/min恒速電磁攪拌。分別于2、4、6、8、10、12、16、20、24、30、36、48 h各取出0.2 ml接收液(取液后迅速補(bǔ)充等量接收液)，HPLC法測(cè)定含量，累積滲透量按文獻(xiàn)[14]計(jì)算。

2.2.3皮膚樣液的制備

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取下皮膚有效擴(kuò)散部位，用蘸有乙醇的棉簽擦凈表面殘留藥物。采用組織勻漿法，取給藥部位皮膚，剪碎勻漿，加入1 ml空白接收液，超聲提取20 min，渦旋振蕩3 min，在11 000×g離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，HPLC法測(cè)定含量。整個(gè)過程應(yīng)避光操作。

2.3 分布均勻性實(shí)驗(yàn)

2.3.1亞甲基藍(lán)染色觀察

采用新鮮的離體裸鼠背部皮膚置于泡沫塑料平板上，四周用大頭釘固定，盡量使皮膚保持自然狀態(tài)下的張力。按前述方法4個(gè)交叉方向分別處理不同次數(shù)后，用亞甲基藍(lán)染液染色2 min，隨后清水洗去染液，紗布擦去皮膚表面的殘余染料和水分，用數(shù)碼相機(jī)拍照觀察微針不同處理次數(shù)時(shí)微針孔的分布情況。

2.3.2激光共聚焦顯微鏡觀察

離體裸鼠皮膚不同次數(shù)處理后，按照Franz擴(kuò)散池實(shí)驗(yàn)方法將1%FITC溶液加入給藥室，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行12 h后取下皮膚，擦去多余藥液，用激光共聚焦顯微鏡觀察在488 nm激發(fā)波長下熒光素在皮膚內(nèi)的分布。

2.3.3皮膚內(nèi)藥物吸收實(shí)驗(yàn)

裸鼠6只，皮膚消毒后背部兩側(cè)各標(biāo)記出對(duì)稱的1 cm×1 cm區(qū)域，兩區(qū)域間隔3 cm，分別處理1、3、5、8次，給予0.1 g維A酸乳膏。給藥12 h后裸鼠拉頸處死，取下背部涂藥區(qū)域皮膚。用蘸有乙醇的棉簽擦凈表面殘留藥物，每隔100m冰凍切片，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定皮膚滯留藥量。

2.4 皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)

2.4.1TEWL測(cè)量法

取裸鼠6只，采用1%戊巴比妥鈉注射液(劑量按75 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，背部消毒后分別標(biāo)記約1 cm2圓形區(qū)域，25℃、相對(duì)濕度60%，穩(wěn)定30 min，按前述處理方式分別處理1、3、5、8、10次，對(duì)照組不做處理。處理前測(cè)定基礎(chǔ)值，分別于處理后0、20、40、60、80、100、120 min，以及3、4、6、8、12、24、36、48 h將探頭輕輕按壓于所標(biāo)記區(qū)域，記錄數(shù)據(jù)。

2.4.2激光多普勒血流量法

裸鼠5只按照前述方法麻醉后編號(hào)，25℃、相對(duì)濕度60%，穩(wěn)定30 min。背部消毒后分別標(biāo)記約1 cm2圓形區(qū)域，標(biāo)記區(qū)域避開大血管。分別用滾輪微針處理1、3、5、8、10次，分別于處理前、處理后0、20、40、60、80、100、120 min內(nèi)測(cè)定皮膚血流量。處理前為基礎(chǔ)血流值，血流量以血流灌注單位(blood perfusion units，BPU)為單位。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 體外滲透效果

微針處理不同次數(shù)后維A酸的滲透效果，見表1。微針處理次數(shù)越多，促透效果越好。1、3、5、8、10次維A酸的48 h累積滲透量分別為對(duì)照組的1.74、2.08、2.56、2.85、3.06倍，滲透速率分別為對(duì)照組的1.75、2.17、2.58、3.00、4.08倍；皮膚中滯留藥量分別為對(duì)照組的1.27、1.85、2.28、2.78、2.80倍。與微針處理8次相比，微針處理10次的48 h累積滲透量和滲透速率均具有顯著性差異(P<0.05)。但是，兩者在皮膚中滯留藥量無顯著性差異(P>0.05)。

表1 微針處理次數(shù)對(duì)維A酸滲透效果及皮膚滯留藥量的影響

*P<0.05，與對(duì)照組比較；#P<0.05，與處理8次組比較

3.2 分布均勻性

3.2.1亞甲基藍(lán)染色和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)

微針不同處理次數(shù)對(duì)滲透分布的影響，見圖1。亞甲藍(lán)染色結(jié)果(圖1A)可見微針處理次數(shù)較少時(shí)，微針孔較少且分布不均，并且由于皮膚彈性等問題會(huì)造成有些部位微針孔不明顯甚至沒有(圖1Ab、圖1Ac)，隨著微針處理次數(shù)不斷增加，微針孔逐漸密集且均勻分布度提高，微針處理5次以上時(shí)，出現(xiàn)部分針眼重疊而皮膚破損現(xiàn)象；激光共聚焦檢測(cè)熒光素FITC結(jié)果(圖1B)與圖1A類似，隨著微針處理次數(shù)的增加，藥物滲透點(diǎn)逐漸增多并趨于均勻。

圖1 微針不同處理次數(shù)時(shí)裸鼠皮膚的滲透分布 A.亞甲基藍(lán)染色圖；B.激光共聚焦測(cè)試圖；a.空白對(duì)照組；b.1次組；c.3次組；d.5次組；e.8次組；f.10次組

3.2.2在體皮膚內(nèi)藥物吸收實(shí)驗(yàn)

給藥12 h，微針分別處理1、3、5、8次對(duì)裸鼠皮膚內(nèi)維A酸吸收均勻度的影響結(jié)果見圖2。1 cm×1 cm面積的裸鼠背部皮膚，每100 μm予以均勻切片，共獲得10張切片，測(cè)定皮膚中藥物含量發(fā)現(xiàn)，微針處理1、3、5、8次，皮膚中滯留藥量均值分別為(0.17 ± 0.07)μg、(0.23 ± 0.05)μg、(0.32 ± 0.07)μg、(0.39 ± 0.08)μg，其皮膚中滯留藥量范圍分別為0.06～0.41 μg、0.14～0.33 μg、0.27～0.38 μg、0.33～0.45 μg。以上結(jié)果表明，微針處理1次時(shí)裸鼠皮膚中維A酸藥物滯留量均勻度相對(duì)較差，但是微針處理3次以上時(shí)，皮膚中滯留藥量的均勻度明顯提高。

圖2 微針不同處理次數(shù)對(duì)裸鼠皮膚內(nèi)維A酸吸收均勻性的影響

3.3 皮膚刺激性

3.3.1TEWL測(cè)量法

微針不同處理次數(shù)對(duì)皮膚水分流失的影響，見圖3。微針處理后皮膚水分流失量均有所增加，處理1次、3次時(shí)，TEWL值僅微弱增加，平均失水量增加(19.01 ±5.54)和(26.60±4.38)g/(m2·h)。但是當(dāng)微針處理皮膚5次或8次時(shí)，TEWL值分別顯著增加至(67.82 ±8.75)和(93.17 ±11.23) g/(m2·h)。使用10次時(shí)達(dá)到最高值，為(122.02 ±14.90)g/(m2·h)。由圖3可見，各處理組TEWL值均在微針處理后瞬間增至最高，而后逐漸下降并緩慢恢復(fù)基線。處理1、3、5次恢復(fù)基線時(shí)間為24 h，微針處理8次、10次后36 h恢復(fù)基線。

圖3 微針不同處理次數(shù)對(duì)裸鼠皮膚TEWL值的影響

觀察皮膚表面發(fā)現(xiàn)，處理次數(shù)為1次、3次、5次時(shí)，僅出現(xiàn)輕、中度紅斑，且24 h內(nèi)褪去。處理次數(shù)為8次和10次時(shí)，裸鼠處理部位皮膚在第2天出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，皮膚增厚，而5次及以下未見該現(xiàn)象。

3.3.2激光多普勒血流量法

微針不同處理次數(shù)對(duì)裸鼠皮膚血流量的影響，見圖4。隨著微針處理次數(shù)的增加，皮膚血流量均不同程度的增加。微針使用1次和3次時(shí)，皮膚血流量增加較少，分別為(5.31±0.89)BPU和(10.27±1.40)BPU，但是20 min后恢復(fù)基線值。處理次數(shù)為5、8、10次時(shí)，皮膚血流量迅速急劇增加，除了8次、10次組在2 h恢復(fù)正常血流外，其余處理組均在1 h內(nèi)恢復(fù)基線。

圖4 微針不同處理次數(shù)對(duì)裸鼠皮膚血流量的影響

4 討論

滾輪微針處理1、3、5、8、10次時(shí)，處理次數(shù)越多，裸鼠皮膚的維A酸促透效果越好，皮膚中滯留藥量也越高，但是皮膚中滯留藥量在處理8次和10次時(shí)無顯著性差異(P>0.05)。亞甲基藍(lán)染色和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)均顯示處理次數(shù)增加，針孔分布均勻度提高。在體皮膚內(nèi)藥物吸收實(shí)驗(yàn)顯示，處理1次時(shí)裸鼠皮膚中滯留藥量均勻性較差，但是處理3次以上時(shí)皮膚中滯留藥量均勻性明顯改善。上述實(shí)驗(yàn)表明，滾輪微針處理次數(shù)越多，裸鼠皮膚藥物的促透作用越好[9]。亞甲基藍(lán)染色結(jié)果顯示，處理5次以上時(shí)，出現(xiàn)部分針眼重疊而皮膚破損現(xiàn)象。TEWL測(cè)量法和激光多普勒法分別通過皮膚表面失水量和皮膚血流的變化考察皮膚的受刺激程度。TEWL測(cè)量法顯示處理5次以下皮膚保護(hù)水分流失的屏障功能恢復(fù)時(shí)間為24 h，處理8次以上為36 h。激光多普勒血流量檢測(cè)結(jié)果顯示，處理5次以下對(duì)皮膚血流刺激影響的恢復(fù)時(shí)間為1 h，處理8次以上為2 h。以上結(jié)果說明，滾輪微針處理次數(shù)5次以下時(shí)，裸鼠皮膚的屏障功能破壞程度較小，即皮膚刺激性較低。綜上，基于安全性和有效性，課題組認(rèn)為采用滾輪微針4個(gè)交叉方向各使用5次，相對(duì)較為適合裸鼠皮膚的促透研究[9]。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)比微針處理不同次數(shù)對(duì)皮膚的刺激性影響，為避免藥物對(duì)結(jié)果的影響，考察刺激性時(shí)各組均未給予維A酸乳膏。

維A酸是臨床常用的皮膚治療藥物，具有調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞分化和增殖、抑制皮脂腺分泌、抗炎、抑制皮膚光老化等作用，是主要的治療痤瘡藥物[10]。該藥物自身具有熒光性，在405 nm激發(fā)波長下可顯示藍(lán)色熒光，因此，實(shí)驗(yàn)選用維A酸為模型藥物進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察(CLSM)掃描實(shí)驗(yàn)。但是，均勻性實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，維A酸的熒光淬滅迅速，需嚴(yán)格避光條件以及迅速確定位點(diǎn)進(jìn)行掃描，而本實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長且條件有限，拍攝結(jié)果并不理想。故均勻性實(shí)驗(yàn)部分CLSM換用FITC熒光素，可較長時(shí)間操作和拍攝[11]。

采用TEWL測(cè)量法、激光多普勒血流量法評(píng)價(jià)皮膚刺激性，是多角度評(píng)價(jià)皮膚刺激性的經(jīng)典方法，分別通過皮膚表面失水量和皮膚血流的變化考察皮膚屏障接受刺激的程度[2]。