周 靜，吳 杲,馬福家

(1.寧波市婦女兒童醫(yī)院，浙江 寧波，315012；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院虹口院區(qū),上海 200081；3.海軍特色醫(yī)學(xué)中心藥劑科，上海 200052)

我國(guó)每年新發(fā)現(xiàn)肺癌病例數(shù)約為70萬(wàn)[1]，而肺癌致死率已上升至惡性腫瘤病死率的首位[2]，尋找新的潛在肺癌基因治療靶點(diǎn)，開發(fā)更為有效的肺癌治療方案，已成為關(guān)乎全民健康的迫切問(wèn)題。hsa-miRNA-30a-5p定位于人6號(hào)染色體，其家族與腫瘤的相關(guān)報(bào)道多集中于肝癌及乳腺癌研究領(lǐng)域。A類清道夫受體5-SCARA5，位于8號(hào)染色體短臂，被稱為“低調(diào)的抑癌高手”。SCARA5在肝癌、宮頸癌和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，與這些類型的腫瘤侵襲和遷移也有密切的關(guān)系[3]。但與肺癌的相關(guān)研究未見有相關(guān)報(bào)道。在本研究中，我們擬對(duì)臨床肺癌標(biāo)本中的hsa-miRNA-30a-5p 和SCARA5表達(dá)及相關(guān)性做出檢測(cè)和分析，用低通量方法做進(jìn)一步驗(yàn)證hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5的表達(dá)差異，同時(shí)分析兩者的相關(guān)性，在此基礎(chǔ)上，我們通過(guò)生物信息學(xué)分析hsa-miRNA-30a-5p 和SCARA5基因3′-UTR區(qū)的結(jié)合關(guān)系，并通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因法進(jìn)行證實(shí)，最終擬通過(guò)干預(yù)A549細(xì)胞內(nèi)hsa-miRNA-30a-5p含量來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖活性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人肺癌標(biāo)本及癌旁組織取自解放軍第455醫(yī)院，人肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑盒(Trizol)及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(M-MLV)均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體(PGL3-promoter)和熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(Promega公司)，SCARA5蛋白一抗及二抗均購(gòu)自美國(guó)Santacruz公司，細(xì)胞及組織總蛋白提取及定量試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，miRNA合成及測(cè)序均由上海生工工程有限公司進(jìn)行，MTT(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide)和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma公司，無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Qiagen公司)，熒光定量檢測(cè)試劑盒、限制性內(nèi)切酶、連接酶、切膠回收試劑盒均購(gòu)自Takara公司,pshRNA基因沉默表達(dá)載體(美國(guó)Systermbio公司)。

1.2 儀器和設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，水平離心機(jī)、高速低溫離心機(jī)以及微量移液器(Eppendorf公司)，電泳儀、垂直電泳槽及轉(zhuǎn)膜儀(上海天能公司)，酶標(biāo)儀及紫外分光光度檢測(cè)儀(Thermo公司)，PCR儀(BioRad公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 肺癌標(biāo)本中hsa-miRNA-30a-5p及SCARA5

蛋白含量檢測(cè)

收集肺腺癌及其癌旁組織5對(duì)，組織取好之后用生理鹽水漂洗，后用濾紙吸干水分，然后將組織裝入凍存管，編號(hào)后液氮保存。開始檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前，取出液氮保存的組織樣本，切取2份各200 mg左右的組織，每份組織加入1 ml經(jīng)4℃預(yù)冷的Trizol，使用電動(dòng)勻漿器進(jìn)行組織勻漿，勻漿液4℃下以12 000×g離心2 min，收集上清液，然后酚氯仿法提取組織Total RNA。RNA通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察完整性，并通過(guò)紫外分光光度儀檢測(cè)RNA濃度。取2 μg RNA經(jīng)M-MLV反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，熒光定量法檢測(cè)組織中hsa-miRNA-30a-5p含量。另取相同大小組織，加入1 ml組織裂解液T-MER，經(jīng)充分勻漿后進(jìn)行組織蛋白提取和定量，實(shí)驗(yàn)過(guò)程完全按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，蛋白提取完成后，通過(guò)Western blotting檢測(cè)組織中SCARA5蛋白相對(duì)含量。

2.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5

(NM_173833.5) 3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)

采用Targetscan預(yù)測(cè)軟件對(duì)SCARA5(NM_173833.5) 3′-UTR區(qū)與hsa-miRNA-30a-5p進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖2A)，hsa-miRNA-30a-5p在SCARA5的3′-UTR區(qū)存在8個(gè)堿基的種子區(qū)“5′-UGUUUACA-3′”。

2.3 載體構(gòu)建

化學(xué)法合成長(zhǎng)鏈DNA，5′-CTAGATGCATTTCAGGGACTGCATTTCAGGGAC TGCATTTCAGGGAC-3′，下游引物，5′-AGATC GTCCCTGAAATGCAGTCCCTGAAATGCAGTCCCTGAAATGCA-3′，兩端分別添加XbaⅠ酶切位點(diǎn)，片段包含hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5基因3′UTR區(qū)結(jié)合位點(diǎn)，長(zhǎng)鏈退火形成雙鏈DNA，后克隆至熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體PGL3-promoter，重組載體經(jīng)序列分析后命名為野生型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pGL3-WT-SCARA5。使用同樣的方法將預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行錯(cuò)義突變，即由“5′-UGUUUACA-3′”突變?yōu)椤?′- AUUCUGUA-3′”，構(gòu)建突變型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pGL3-MT-SCARA5，根據(jù)SCARA5(NM_173833.5)的基因信息，設(shè)計(jì)針對(duì)其編號(hào)取的siRNA序列5′-GCAACGCCAGCGAGGACAC-3′,然后根據(jù)siRNA序列設(shè)計(jì)兩條互補(bǔ)的長(zhǎng)鏈DNA，上下游引物分別添加酶切位點(diǎn)BamHΙ和EcoRΙ及保護(hù)堿基，上游引物序列：5′- GATCCGCAACGCCAGCGAGGACAC CTTCCTGTCAGAGTGTCCTCGCTGGCGTTGCTTTTTG -3′；下游引物序列：5′- AATTCAAAAAGCAACGCCAGCGAGGACAC TCTGACAGGAAG

GTGTCCTCGCTGGCGTTGCC -3′，雙鏈DNA經(jīng)退火形成雙鏈DNA，并克隆至基因表達(dá)載體，構(gòu)建SCARA5基因表達(dá)載體pshRNA- SCARA5。 重組載體經(jīng)序列分析無(wú)誤后，擴(kuò)增轉(zhuǎn)化菌株，進(jìn)行無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA提取，提取過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，使用dH2O將質(zhì)粒DNA終濃度調(diào)整至500 ng/μl,-20℃保存。

化學(xué)合成miRNA-30a-5p mimics(5′ -uGuAAACAuCCuCGACuGGAAG-3′),inhibitor(5′-CuuCCAGuCGAGGAuGuuuACA-3′)及陰性對(duì)照(NC,5′-CuuCCAGuCGAGGAuGuuuACA- 3′),RNA末端加tt保護(hù)堿基。

2.4 Hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5靶位關(guān)系的驗(yàn)證

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，胰酶消化法制備細(xì)胞懸液，臺(tái)酚藍(lán)染色后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，使用完全培養(yǎng)基(RPMI1640+10%FBS)調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，接種細(xì)胞于6孔板，每孔加2 ml細(xì)胞懸液，37℃和5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，參照Lipofectmaine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行質(zhì)粒和RNA共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染分為9組：A549對(duì)照組、pGL3-WT-SCARA5組、pGL3-MT-SCARA5組、miRNA30a-5p NC+pGL3-WT-SCARA5組、miRNA30a-NC+ pGL3-MT-SCARA5組、miRNA30a-5p mimics+pGL3-WT-SCARA組、miRNA30a-5p mimics+pGL3-MT-SCARA組、miRNA30a-5p inhibitor+pGL3-WT-SCARA組和miRNA30a-5p inhibitor+pGL3-MT-SCARA組，每組細(xì)胞轉(zhuǎn)染100 ng的海腎熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒(pGL3-TK)作為熒光霉素活性的檢測(cè)參照。A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，使用Promega公司的雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)和熒光素酶檢測(cè)儀，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性。

2.5 轉(zhuǎn)染miRNA30a-5p inhibitor對(duì)肺癌A549的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，0.25%胰酶消化后收集細(xì)胞，1 500×g水平離心2 min，收集細(xì)胞，使用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ml，接種細(xì)胞到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔添加2 ml細(xì)胞懸液，37 ℃和5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染過(guò)程及RNA用量完全參照試劑盒Lipofectmaine 2000說(shuō)明書。實(shí)驗(yàn)分為4組，A549細(xì)胞對(duì)照組、miRNA-30a NC轉(zhuǎn)染組、miRNA-30a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染組和miRNA-30a-5p inhibitor且pshRNA-SCARA5轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞Total RNA，熒光定量法檢測(cè)hsa-miRNA-30a-5p含量，同時(shí)，提取細(xì)胞總蛋白，用Western blotting法檢測(cè)胞內(nèi)SCARA5蛋白相對(duì)含量。

2.6 A549細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分為4組，A549細(xì)胞對(duì)照組、miRNA-30a-5p NC轉(zhuǎn)染組、miRNA-30a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染組和miRNA-30a-5p inhibitor且pshRNA-SCARA5轉(zhuǎn)染組。取轉(zhuǎn)染后48 h的A549細(xì)胞，胰酶消化法制備細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞沉淀，用含10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ml，接種細(xì)胞到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔添加100 μl細(xì)胞懸液，輕晃培養(yǎng)板使其分布均勻，37℃和5 % CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞，并于接種后的24、48、72 h，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。檢測(cè)前，每孔細(xì)胞加入5 mg/ml MTT溶液10 μl，輕晃使其分布均勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清液，每孔加入150 μl DMSO溶液，37℃孵育15 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)(A570)細(xì)胞液的吸光度值，根據(jù)吸光度值制作細(xì)胞對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)曲線。

2.7 real time-PCR檢測(cè)hsa-miRNA-30a-5p含量

取2 μg 的Total RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，反轉(zhuǎn)錄過(guò)程使用特異反轉(zhuǎn)錄引物，H.sapiens 6 snRNA:5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′；hsa-miRNA-30a-5p，5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTG GAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTTCC-3′，取2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR模板，熒光定量法檢測(cè)hsa-miRNA-30a-5p含量。2ΔΔCt法分析定量結(jié)果，內(nèi)參選用U6(NM_001101.3)。PCR引物序列：U6上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGC AGCACAT-3′，下游引物5′-TACCTTGCGAAGTGC TTAAAC-3′； hsa-miRNA-30a-5p上游引物5′-GCCGGCGCCCGAGCT CTGGCTC-3′，下游引物5′- TGTAAACATCCTCGACTGGAAG -3′。PCR使用20 μl體系，其中，SYBR Premix Ex Taq 10 μl，引物(20 μmol/L)各取0.2 μl，模板使用量為2 μl，反應(yīng)體系用dH2O補(bǔ)足。PCR條件：95℃變性10 s；58℃退火10 s；72 ℃延伸10 s，循環(huán)數(shù)設(shè)置為40。結(jié)果分析中，以U6作為對(duì)照，通過(guò)Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Ct值通過(guò)交點(diǎn)法計(jì)算獲得，即通過(guò)擴(kuò)增曲線與閾值線的交點(diǎn)來(lái)計(jì)算Ct值。相對(duì)定量的結(jié)果則通過(guò)ΔΔCt法進(jìn)行解析，目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量為2ΔCt=2Ctm-Ctn。

2.8 Western blotting檢測(cè)SCARA5蛋白含量

將濃度測(cè)定后的總蛋白以每組10μl進(jìn)行垂直電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠濃度為10%，經(jīng)110 V電壓90 min電泳后，立春紅染色觀察蛋白條帶是否完整，400 mA電流轉(zhuǎn)膜90 min，轉(zhuǎn)膜后以5%的脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃一抗過(guò)夜孵育，SCARA5和GAPDH一抗(TBST)稀釋比分別為1∶300和1∶1 000；TBST洗膜3次，加入二抗孵育2 h，羊抗鼠二抗稀釋比為1∶2 000；TBST洗膜3次，添加化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)底物，暗室曝光，掃描曝光底片，統(tǒng)計(jì)目的條帶光密度值(D值)。D值目的蛋白/D值GAPDH，即為SCARA5蛋白的相對(duì)含量。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 腫瘤標(biāo)本中hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5蛋白含量檢測(cè)

Hsa-miRNA-30a-5p相對(duì)含量檢測(cè)數(shù)據(jù)(圖1A)顯示，與癌旁組織比較，肺癌組織中的hsa-miRNA-30a-5p含量明顯降低，組間差異顯著(P<0.05)，數(shù)據(jù)以(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù); SCARA5蛋白含量檢測(cè)結(jié)果(圖2B)顯示，肺癌組織和癌旁組織中蛋白含量分別為(1.00±0.38)和(4.29±1.18)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，組間差異顯著(P<0.05)。

圖1 腫瘤標(biāo)本中hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5蛋白含量檢測(cè) A.肺癌及癌旁組織中hsa-miRNA-30a-5p相對(duì)含量檢測(cè)結(jié)果，U6為內(nèi)參；B.肺癌及癌旁組織中SCARA5蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，GAPDH為參照蛋白；**P<0.01，與腫瘤組比較

3.2 Hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5靶位關(guān)系驗(yàn)證

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，hsa-miRNA-30a-5p在SCARA5基因3′UTR區(qū)有8個(gè)堿基的結(jié)合位點(diǎn)(圖2A)。分別將miRNA-30a-5p mimics、miRNA-30a-5p inhibitor、miRNA-30a-5p NC與兩組熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pGL3-WT- SCARA5和 pGL3-MT- SCARA5進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48 h，熒光素酶相對(duì)活性檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2B)，miRNA-30a-5p mimics能夠明顯抑制野生型熒光素酶表達(dá)載體熒光素酶活性，從(3.98±0.61)降至(1.62±0.31)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而miRNA-30a-5p inhibitor則能夠增強(qiáng)野生型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體的熒光素酶活性，(3.98±0.61)上升至(6.27±0.35)，組間差異顯著(P<0.05)；對(duì)于突變型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，無(wú)論miRNA-30a-5p mimics或者miRNA-30a-5p inhibitor都對(duì)其無(wú)明顯影響。以上數(shù)據(jù)和結(jié)果說(shuō)明，hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5基因之間的預(yù)測(cè)靶位確實(shí)存在。

圖2 熒光素酶活性檢測(cè) A.hsa-miRNA-124-3p與SCARA5基因3′UTR結(jié)合位點(diǎn)的生物信息分析；B.A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果注：“+”代表轉(zhuǎn)染，“-”代表不轉(zhuǎn)染*P<0.05，**P<0.01，與pGL3-WT-SCARA5轉(zhuǎn)染組比較

3.3 轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞內(nèi)hsa-miRNA-30a-5p及SCARA5蛋白含量檢測(cè)

A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-30a inhibitor后48 h，細(xì)胞內(nèi)hsa-miRNA-30a-5p含量明顯降低(圖3A)，與對(duì)照組比較，差異顯著(P<0.05)，而miRNA-30a-5pNC轉(zhuǎn)染組hsa-miRNA-30a-5p含量與對(duì)照組比較，無(wú)明顯差異(P>0.05)；蛋白含量檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明(圖3B)， 轉(zhuǎn)染miRNA-30a-5p inhibitor后48 h，細(xì)胞內(nèi)SCARA5含量明顯上升，與細(xì)胞對(duì)照組比較，差異顯著(P<0.05)，而miRNA-30a-5p inhibitor與沉默載體pshRNA-SCARA5共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)SCARA5蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，無(wú)明顯差異(P>0.05)。

3.4 hsa-miRNA-30a-5p含量變化對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的影響

細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后24～72 h，各組細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果(圖4)顯示，轉(zhuǎn)染后48、72 h，與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，miRNA-30a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞增值活性明顯降低(P<0.05)，pshRNA- SCARA5與miRNA-30a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖活性則明顯增強(qiáng)(P<0.01)，恢復(fù)到基因干預(yù)前的水平。

圖3 轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞內(nèi)hsa-miRNA-30a-5p及SCARA5蛋白含量檢測(cè) A.A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，各組細(xì)胞內(nèi) hsa-miRNA-30a-5p含量檢測(cè)結(jié)果；B.A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，各組細(xì)胞內(nèi)SCARA5蛋白含量檢測(cè)結(jié)果*P<0.05,與細(xì)胞對(duì)照組比較

圖4 A549細(xì)胞增殖活性檢測(cè) **P<0.01,與細(xì)胞對(duì)照組(相同時(shí)間點(diǎn))比較

4 討論

微小RNA(miRNA) 屬于內(nèi)源性非編碼RNA，廣泛分布于基因組，其成熟體長(zhǎng)度一般為20～25個(gè)堿基。從遺傳進(jìn)化學(xué)角度來(lái)講，miRNA具有高度保守性。miRNA具有多種生物功能，這些功能主要通過(guò)對(duì)其靶基因的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)，miRNA通過(guò)種子區(qū)可以與其靶基因3′-UTR區(qū)結(jié)合，從而抑制基因翻譯[4]。miRNA與腫瘤關(guān)系密切，可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)、增殖、遷移、侵襲，通過(guò)參與多種信號(hào)通路的靶蛋白的克隆形成和血管生成，參與關(guān)鍵的發(fā)病機(jī)制[5-6]。Winther等研究表明，miRNA-21可作為食管腺癌及食管鱗癌的獨(dú)立預(yù)后因素[7]。Wang等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-128b在胃癌的發(fā)病進(jìn)程中起重要作用，過(guò)表達(dá)miRNA-128b可抑制胃癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡[8]。miRNA-10a，miRNA-26，miRNA-126a，miRNA-210，miRNA-342和miRNA-519a被證實(shí)可以作為乳腺癌的生物學(xué)標(biāo)志物，且與乳腺癌對(duì)一線用藥他莫昔芬的藥物敏感性有關(guān)[9]。miRNA-29b及miRNA17則被證實(shí)在腸癌的調(diào)控機(jī)制失活中扮演了關(guān)鍵角色[10-11]。這些研究表明，miRNA是多種腫瘤發(fā)病機(jī)制的內(nèi)在原因，而其也可以成為腫瘤基因治療的切入點(diǎn)。過(guò)去的4年中，肺癌的總體5年生存率僅上升了4%，早期較低的診斷率是改善肺癌預(yù)后的主要障礙，肺癌切除術(shù)患者生存率大于80%，這也表明肺癌的早期檢測(cè)和診斷對(duì)提高患者的生存率至關(guān)重要，而血清中miRNA作為非侵入性肺癌生物標(biāo)志物被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)和證實(shí)[12]。Chen等研究證實(shí)，miRNA-25可以通過(guò)其靶基因RGS3調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549和H520的增殖和侵襲[13]。另外，還有miRNA-143-3p,miRNA-218,miRNA130家族[14-16]和miRNA-630[17]均與肺癌的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制有關(guān)。所有這些研究表明，miRNAs在肺癌的發(fā)病機(jī)制中很可能形成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，對(duì)相關(guān)的miRNA進(jìn)行研究，將有助于尋找新的miRNA靶基因和新的肺癌基因治療靶點(diǎn)[18]。

SCARA5于2009年被我國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，一系列的研究表明，SCARA5基因作為肝癌抑制基因，在肝癌組織中表達(dá)下降，SCARA5的肝癌抑制作用可能是通過(guò)抑制FAK蛋白的激活來(lái)實(shí)現(xiàn)的[3]。Khamas 等通過(guò)研究證實(shí)，SCARA5在腸癌中表達(dá)異常[19]。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中過(guò)表達(dá)SCARA5，可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，顯著降低克隆形成、遷移和體外侵襲，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明，SCARA5過(guò)表達(dá)可以抑制皮下腫瘤的增殖[20]。Liu等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SCARA5與A549細(xì)胞的EMT有關(guān),并認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄因子SNAIL1的負(fù)調(diào)控作用所致[21]。Hsa-miRNA-30a-5p及其家族是高度保守的miRNA家族，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，hsa-miRNA-30a-5p下游目標(biāo)包括轉(zhuǎn)錄因子如ITGB3、DTL、EWS-FLI和CD99等，通過(guò)調(diào)節(jié)這些下游目標(biāo)蛋白的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌、尤文瘤等類型腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[22-24]。Hsa-miRNA-30a-5p與肺癌的相關(guān)研究較少，與SCARA5的相關(guān)研究則目前未見報(bào)道。我們?cè)诜伟┙M織中驗(yàn)證SCARA5的表達(dá)，數(shù)據(jù)顯示SCARA5在肺癌組織中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織，hsa-miRNA-30a-5p在肺癌與癌旁組織中的表達(dá)與SCARA5呈顯著負(fù)相關(guān)。

我們的研究顯示，hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5具有顯著負(fù)相關(guān)性，hsa-miRNA-30a-5p在肺癌中的高表達(dá)導(dǎo)致了腫瘤組織內(nèi)SCARA5表達(dá)的顯著降低。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，通過(guò)miRNA-30a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染可以明顯抑制A549細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增殖活性，當(dāng)miRNA-30a-5p inhibitor與SCARA5基因沉默同時(shí)進(jìn)行時(shí)，A549細(xì)胞增殖活性又恢復(fù)到基因干預(yù)前的水平。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，miRNA-30a-5p inhibitor確實(shí)是通過(guò)抑制A549細(xì)胞內(nèi)hsa-miRNA-30a-5p的表達(dá)，增強(qiáng)了其靶蛋白SCARA5含量，而高表達(dá)的SCARA5則明顯抑制了A549細(xì)胞的增殖活性，因此在肺癌細(xì)胞A549中，SCARA5顯然作為抑癌蛋白發(fā)揮作用。

本研究的意義在于證實(shí)hsa-miRNA-30a-5p是肺癌細(xì)胞中SCARA5蛋白低表達(dá)的主要因素，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)hsa-miRNA-30a-5p，可以顯著上調(diào)其靶蛋白SCARA5的表達(dá)，進(jìn)而顯著抑制腫瘤細(xì)胞A549的增殖活性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們，hsa-miRNA-30a-5p可成為潛在的肺癌基因治療靶點(diǎn)。