于金玲，沈衛(wèi)達(dá)，高蓓敏，趙海燕，秦 琛

0 引 言

三陰性乳腺癌（three-negative breast cancer，TNBC）是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤［1］。TNBC根據(jù)癌細(xì)胞表現(xiàn)特性可分為4個(gè)亞型，分別為免疫調(diào)節(jié)型、腔面雄激素受體型、基底樣免疫抑制型和間質(zhì)型。不同亞型具有獨(dú)特的基因突變位點(diǎn)，而這些基因突變位點(diǎn)的研究是臨床基礎(chǔ)研究的方向。由于TNBC存在分子生物學(xué)異質(zhì)性，病理組織學(xué)分級(jí)差，腫瘤侵襲性強(qiáng)，易局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，缺乏治療靶點(diǎn)，預(yù)后極差，3年后復(fù)發(fā)率可達(dá)到40%～50%［2］。因此深入研究TNBC分子生物學(xué)轉(zhuǎn)移機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的TNBC治療靶點(diǎn)，開展針對(duì)性的精準(zhǔn)靶向治療，對(duì)提高TNBC的生存具有重要意義。

目前研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在乳腺癌中存在異常表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存相關(guān)，并調(diào)控相應(yīng)的靶基因參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程［3-4］。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-182在TNBC組織中高表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移，與TNBC復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)［5］。miR-182通過調(diào)控相應(yīng)靶基因表達(dá)發(fā)揮促癌作用的機(jī)制尚未明確。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-182與MTSS1有潛在靶結(jié)合位點(diǎn)。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)合位點(diǎn)，并探討miR-182調(diào)控MTSS1表達(dá)對(duì)TNBC侵襲及轉(zhuǎn)移的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象本研究獲得上海長(zhǎng)寧區(qū)婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)CNFBLLQKW-2016003），所有患者均知情同意。入選2010年1月至2015年12月期間上海市長(zhǎng)寧區(qū)婦幼保健院收治的30例TNBC患者，收集其石蠟包埋的癌及癌旁組織。所有患者均在該院施行乳腺癌改良根治術(shù)；發(fā)病年齡30～70歲，中位發(fā)病年齡50.1歲；未絕經(jīng)12例、已絕經(jīng)18例；淋巴結(jié)陽性組13例、陰性組17例；腫瘤病理分期Ⅰ期及Ⅱ期共24例，Ⅲ期6例。入選標(biāo)準(zhǔn)：所有病例術(shù)前均未接受過放療及化療，全部標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。如同側(cè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移＞3枚或腫瘤直徑＞5 cm者術(shù)后給予放療。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受過放療及新輔助化療者；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者；特殊病理類型乳腺癌。

1.2 材料與試劑MCF-7低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株、MDA-MB-231高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株購自中國(guó)上海中科院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine 2000購自美國(guó)Invitrogen公司；CCK8試劑購自日本同仁化工；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司。

1.3 儀器與設(shè)備生物安全柜購自德國(guó)Thermo公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自德國(guó)Thermo；熒光顯微鏡購自日本Nikon公司；Milli-Q超純水制備系統(tǒng)購自德國(guó)Millipore公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿購自美國(guó)CORNING-Costar公司；酶標(biāo)儀購自德國(guó)PerkinElmer公司。

1.4 蠟塊組織中提取RNA及熒光定量PCRTNBC石蠟包埋組織切成≥20μm的薄片，取≤80μm石蠟組織，用于常規(guī)脫蠟和蛋白酶消化。根據(jù)石蠟組織提取試劑盒的說明，用離心柱洗脫總RNA。測(cè)定RNA溶液A260/A280吸光度值，并計(jì)算其濃度和純度。A260/A280比值在1.8～2.1之間可用于cDNA的合成。2%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，RNA在-80℃保存。Trizol抽取總RNA，并用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司，日本）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用 Sybr GreenMaster Mix（Takara公司，日本）進(jìn)行定量PCR。以GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化參照，使用ΔΔCT法計(jì)算不同基因的相對(duì)表達(dá)。

1.5 細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)在MCF-7細(xì)胞分為Si-MTSS1組與SiNC組，在MCF-7細(xì)胞中沉默MTSS1表達(dá)；MDA-MB-231細(xì)胞分為pcDNA3.1-MTSS1組與pcDNA3.1 NC組，在MDA-MB-231細(xì)胞過表達(dá)MTSS1。將MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞分別接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，1×105細(xì)胞/孔。18 h后MCF-7轉(zhuǎn)染Si-MTSS1為實(shí)驗(yàn)組，SiNC為對(duì)照組；高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MTSS1為實(shí)驗(yàn)組，pcDNA3.1 NC為對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)。lipofectamineRNAiMAX的用量為0.25μL/孔，RNA的用量為5 pmol/孔，6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后，Matrigel膠和DMEM培養(yǎng)基按1︰3的比例混合后每孔上室加入20μL，放入37℃培養(yǎng)箱靜置30 min使膠凝結(jié)。將轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞消化打散，取100 000個(gè)細(xì)胞，加入transwell小室上層，總體積為100μL，不含血清，每組用3個(gè)小室。小室下層中加入600μL含有10%血清的培養(yǎng)基。48 h后將小室用4%多聚甲醛固定，然后將上層膜的細(xì)胞輕輕擦除，下層膜的細(xì)胞用DAPI染色。將染色后的下層膜的細(xì)胞置于熒光顯微鏡下拍照，每個(gè)小室隨機(jī)選取5個(gè)視野，20倍物鏡。對(duì)每張照片中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及突變實(shí)驗(yàn)通過網(wǎng)站 http：//www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/查詢MTSS1基因的3′UTR序列存在3個(gè)目的基因片段（262-268，1083-1089，1928-1935）為miR-182潛在結(jié)合位點(diǎn)，分別命名為MTSS1-U1、MTSS1-U2和 MTSS1-U3。其中，MTSS1-U2（1083-1089）的靶點(diǎn)為：UUGGAGUCUAGCAACUUGCCAAU；U替換為T后：TTGGAGTCTAGCAACTTGCCAAT；合 成 引 物 ：MTSS1-U2-FP：5'CTAGTCTAGAATCTCCCACTTCAGTTTCTCGT3'；MTSS1-U2-RP： 5' GGGAATTCCATATGCCCAGAATACAAAAAAAGGACAG 3'。

根據(jù)has-miR-182靶點(diǎn)預(yù)測(cè)信息，將MTSS1基因的3個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)分別構(gòu)入熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒PGL3-3'UTR中，將構(gòu)建成功的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒與miR-182 mimics共轉(zhuǎn)染至低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性是否降低。具體過程如下：將MCF-7細(xì)胞接種于48孔板。細(xì)胞鋪板后24 h，使用Poly-Fecter轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔用量如下：has-miR-182 mimics 100 ng，Luc-UTR報(bào)告基因質(zhì)粒100 ng，內(nèi)參Renilla 5 ng（證明轉(zhuǎn)染成功，并用作數(shù)據(jù)歸一化處理）。以陰性參照siRNA（NC）100 ng加Luc-UTR報(bào)告基因質(zhì)粒100 ng，內(nèi)參Renilla 5 ng為對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。6 h后換液；轉(zhuǎn)染后48 h裂解細(xì)胞，測(cè)試luciferase活性，測(cè)試結(jié)果為PerkinElmer酶標(biāo)儀讀取的吸光度值。

將包含has-miR-182靶點(diǎn)的MTSS1相應(yīng)靶點(diǎn)序列突變，并將構(gòu)建成功的熒光素酶報(bào)告基因突變質(zhì)粒與miR-182 mimics共轉(zhuǎn)染至低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性是否恢復(fù)，進(jìn)一步明確miRNA的結(jié)合位點(diǎn)。

1.7 細(xì)胞內(nèi)源基因表達(dá)量檢測(cè)MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-182，對(duì)照組轉(zhuǎn)染SiNC。24～48 h后提取RNA，通過RT-qPCR檢測(cè)MTSS1 mRNA表達(dá)量變化；48～72 h后提取蛋白，通過Western blot檢測(cè)MTSS1蛋白表達(dá)量變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。TNBC組織中miR-182與MTSS1表達(dá)根據(jù)數(shù)據(jù)分布采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-182及MTSS1在TNBC癌組織的相對(duì)含量qPCR結(jié)果顯示，TNBC組織中miR-182相對(duì)定量表達(dá)明顯高于癌旁組織［（5.618±2.767）vs（1.315±0.403）］，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-8.409，P=0.000）；MTSS1癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁組織［（0.130±0.009）vs（0.370 ± 0.667）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.961，P=0.006），見圖1。MTSS1在淋巴結(jié)陽性組表達(dá)（0.005±0.003）明顯低于淋巴結(jié)陰性組（0.015±0.009），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.418，P=0.004）。Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果表明，TNBC癌組織中miR-182與MTSS1相對(duì)表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.433，P=0.017）。

圖1 miR-182及MTSS1在TNBC組織中相對(duì)定量表達(dá)Figure 1 Relative quantitative expressions of miR-182 and MTSS1 in the triple-negative breast cancer tissue

2.2 miR-182及MTSS1對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響轉(zhuǎn)染miR-182的MCF-7細(xì)胞膠穿和空穿數(shù)量明顯增多，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.400，P=0.003）；轉(zhuǎn)染 Antagomir-182的 MDA-MB-231細(xì)胞膠穿和空穿數(shù)量明顯減少，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-41.065，P=0.001）。

在MCF-7細(xì)胞中，Si-MTSS1組與SiNC組相比，發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-15.323，P=0.004），提示MTSS1敲低促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的遷移。在MDA-MB231細(xì)胞中，pcDNA3.1-MTSS1組與pcDNA3.1組相比，發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=27.114，P=0.001），提示MTSS1過表達(dá)抑制了乳腺癌細(xì)胞的遷移。見圖2。

圖2MTSS1對(duì)MCF-7及MDA-MB-231遷移的影響Figure 2 Migration and invasiveness of MTSS1 in the MCF-7 and MDA-MB-231 cells

2.3 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及突變實(shí)驗(yàn)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，將質(zhì)粒MTSS1-U2分別與miR-182 mimics共轉(zhuǎn)染至低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，其熒光素酶活性降低較為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.383，P=0.006），見圖 3。結(jié)果表明MTSS1基因的1083-1089靶點(diǎn)（U2）為has-miR-182的結(jié)合靶點(diǎn)。與包含miR-182靶點(diǎn)的3′UTR相比，突變靶點(diǎn)后的3′UTR的luciferase活性更低，即mut-MTSS1-U2包含miR-182的靶點(diǎn)，進(jìn)一步證明了miR-182的結(jié)合位點(diǎn)與預(yù)測(cè)相符合。

圖3 雙熒光素酶驗(yàn)證MTSS1-U2為miR-182結(jié)合靶點(diǎn)Figure 3 MTSS1-U2 confirmed to be the target binding site of miR-182 by dual luciferase assay

2.4 內(nèi)源基因表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組比較，qPCR結(jié)果表明，MCF-7中轉(zhuǎn)染miR-182后MTSS1在mRNA水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-5.918，P=0.027），見圖 4。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCF-7中轉(zhuǎn)染miR-182后MTSS1抗體檢測(cè)在34kd處檢測(cè)到微弱條帶，見圖5。

圖4miR-182過表達(dá)MTSS1mRNA水平變化Figure 4 Relative expression of MTSS1 mRNA in the MCF-7 cells transfected with miR-182

圖5 miR-182過表達(dá)MTSS1蛋白水平變化Figure 5 Relative expression of the MTSS1 protein in the MCF-7 cells transfected with miR-182

3 討 論

TNBC嚴(yán)重危害女性健康，占所有乳腺癌發(fā)病的10%～30%，其復(fù)發(fā)率3年后可達(dá)到40%～50%。TNBC存在分子生物學(xué)異質(zhì)性，具有侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)早、預(yù)后差、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高等特點(diǎn)，且缺乏內(nèi)分泌及抗HER-2治療靶點(diǎn)，仍是乳腺癌治療的難點(diǎn)和熱點(diǎn)［1，6］。

乳腺癌的發(fā)病是一個(gè)多基因突變積累的過程［7］。微小RNA（miRNA）是一類非編碼單鏈RNA，具有18～25個(gè)核苷酸，成熟的miRNA在5′端帶有磷酸基團(tuán)，可通過與靶基因3′端非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，引起靶基因mRNA的降解或翻譯抑制，參與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過程。近年來研究證實(shí)，多種miRNA在乳腺癌中存在異常表達(dá)，并調(diào)控其下游靶基因參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程［3-4］。Liu 等［8］研究發(fā)現(xiàn)miR-182過表達(dá)促進(jìn)卵巢癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。張曙光等［9］發(fā)現(xiàn)MTSS1表達(dá)上調(diào)與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)性相關(guān)，且可抑制食管鱗癌細(xì)胞的侵襲及遷移發(fā)生。Fan等［10］認(rèn)為MTSS1在肝細(xì)胞癌中起腫瘤抑制作用。Vadakekolathu等［11］研究發(fā)現(xiàn)MTSS1可增加乳腺癌細(xì)胞間粘附作用，抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移。既往研究提示miR-182及MTSS1可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要生物學(xué)作用［12］；但均未進(jìn)一步探討其內(nèi)在機(jī)制。Xie等［13］發(fā)現(xiàn)miR-96可通過抑制MTSS1促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移。然而目前尚未有研究報(bào)道TNBC患者miR-182與MTSS1作用機(jī)制關(guān)系。

既往研究發(fā)現(xiàn)miR-182在TNBC癌組織高表達(dá)，與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)miR-182可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移［14］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-182可與FOXF2靶向結(jié)合，下調(diào)其表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌侵襲及遷移，可能是TNBC潛在的治療靶點(diǎn)［5］。本研究中MTSS1在TNBC癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁組織，在TNBC淋巴結(jié)陽性組表達(dá)更低，MDA-MB-231細(xì)胞中過表達(dá)MTSS1可抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲及遷移。這提示MTSS1可能參與了三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，并可能受到miR-182的調(diào)控作用。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了MTSS1基因的1083-1089靶點(diǎn)為miR-182的結(jié)合靶點(diǎn)；miR-182通過與該靶點(diǎn)靶向結(jié)合，導(dǎo)致MTSS1在mRNA及蛋白水平表達(dá)均降低。提示miR-182通過下調(diào)MTSS1表達(dá)，促進(jìn)TNBC侵襲及轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及突變實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在MTSS1的3′UTR端1083-1089靶點(diǎn)為miR-182的結(jié)合靶點(diǎn)。通過qPCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，MCF-7中轉(zhuǎn)染miR-182后，MTSS1表達(dá)量下降。提示miR-182可與MTSS1靶向結(jié)合，下調(diào)其表達(dá)，在TNBC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促癌作用；該靶結(jié)合位點(diǎn)可能是TNBC治療的潛在靶點(diǎn)。

本研究的局限之處在于尚缺乏體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步闡明miR-182及MTSS1的調(diào)控機(jī)制。miR-182/MTSS1信號(hào)通路對(duì)TNBC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的影響，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，TNBC發(fā)生發(fā)展過程中受多種因素影響，miRNA異常表達(dá)可能是其中因素之一［15］。作為一種異質(zhì)性疾病，TNBC較其他分子分型的乳腺癌侵襲性更強(qiáng)，更容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，目前尚缺乏有效的治療手段［16］。TNBC轉(zhuǎn)移的生物學(xué)發(fā)生發(fā)展機(jī)制，目前尚未完全明確。其潛在的分子治療靶點(diǎn)探索有望為TNBC患者帶來新的治療機(jī)會(huì)。