陳娟 李元梅 成伯寧

[摘要] 目的 探討紫杉醇聯(lián)合順鉑對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞SW579增殖、遷移的影響。 方法 在DMEM培養(yǎng)液（含15%胎牛血清）中加入細(xì)胞，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，到80%左右融合后分為試驗(yàn)組、空白對(duì)照組（只含DMEM培養(yǎng)基），試驗(yàn)組又分為3 μmol/L紫杉醇組（紫杉醇組）、30 μmol/L順鉑組（順鉑組）、3 μmol/L紫杉醇+30 μmol/L順鉑聯(lián)合用藥組（聯(lián)合用藥組），MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)活力，流式細(xì)胞數(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，細(xì)胞遷移試驗(yàn)，細(xì)胞侵襲試驗(yàn)，Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)，然后統(tǒng)計(jì)分析各組細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移、侵襲能力、AKT信號(hào)通路、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、細(xì)胞MMP表達(dá)。 結(jié)果 聯(lián)合用藥組細(xì)胞活力、細(xì)胞周期S、G2、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲能力均顯著低于順鉑組、紫杉醇組、空白對(duì)照組（P<0.05），細(xì)胞周期G1顯著高于順鉑組、紫杉醇組、空白對(duì)照組（P<0.05）。順鉑組、紫杉醇組細(xì)胞活力、細(xì)胞周期S、G2、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲能力均顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05），細(xì)胞周期G1均顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05）。聯(lián)合用藥組PTEN/GADPH、P27/GADPH表達(dá)均顯著高于順鉑組、紫杉醇組、空白對(duì)照組（P<0.05），P-AKT/AKT、CyclinD1/GADPH、MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH表達(dá)均顯著低于順鉑組、紫杉醇組、空白對(duì)照組（P<0.05）。順鉑組、紫杉醇組PTEN/GADPH、P27/GADPH表達(dá)均顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），P-AKT/AKT、CyclinD1/GADPH、MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH表達(dá)均顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論 紫杉醇聯(lián)合順鉑能夠顯著抑制甲狀腺癌細(xì)胞SW579增殖、遷移。

[關(guān)鍵詞] 紫杉醇;順鉑;甲狀腺癌;SW579;增殖;遷移

[中圖分類號(hào)] R581? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）20-0043-05

Effect of paclitaxel combined with cisplatin on proliferation and migration of thyroid carcinoma cell line SW579

CHEN Juan LI Yuanmei CHENG Boning

Department of Endocrinology，Xixi Hospital of Hangzhou City，Hangzhou 310023，China

[Abstract] Objective To investigate the effects of paclitaxel combined with cisplatin on the proliferation and migration of thyroid carcinoma cell line SW579. Methods Cells were added to DMEM medium（containing 15% fetal bovine serum）， cultured in a 37℃， 5% CO2 incubator， and divided into test group and blank control group （only DMEM medium） after about 80% confluence. The test group was further divided into 3 μmol/L paclitaxel group（paclitaxel group）， 30 μmol/L cisplatin group（cisplatin group）， 3 μmol/L paclitaxel+30 μmol/L cisplatin combination group（combination group）， The relative viability of the cells was detected by MTT method. The cell cycle， the cell migration assay and the cell invasion assay were detected by flow cytometry. The expression of related proteins were detected by Western blot. And then the cell viability， cell cycle， cell migration， invasion ability， AKT signaling pathway， cell cycle related protein and cell MMP expression were statistically analyzed. Results The cell viability， cell cycle S， G2， cell migration and cell invasion ability of the combination group were significantly lower than those of the cisplatin group， the paclitaxel group and the blank control group （P<0.05）. The cell cycle G1 in the combination group was significantly higher than that of the cisplatin group， the paclitaxel group and the blank control group（P<0.05）. The cell viability， cell cycle S， G2， cell migration and cell invasion ability of cisplatin group and paclitaxel group were significantly lower than the blank control group（P<0.05）， and the cell cycle G1 of cisplatin group and paclitaxel group was significantly higher than that of the blank control group（P<0.05）. The expressions of PTEN/GADPH and P27/GADPH in the combination group were significantly higher than those in the cisplatin group， the paclitaxel group and the blank control group（P<0.05）. The expressions of P-AKT/AKT， CyclinD1/GADPH， MMP-2/GADPH， MMP-9/GADPH in the combination group were significantly lower than those in cisplatin group， paclitaxel group and blank control group（P<0.05）. The expressions of PTEN/GADPH and P27/GADPH in cisplatin group and paclitaxel group were significantly higher than those in blank control group（P<0.05）. The expressions of AKT/AKT， CyclinD1/GADPH， MMP-2/GADPH and MMP-9/GADPH in the cisplatin group and paclitaxel group were significantly lower than the blank control group（P<0.05）. Conclusion Paclitaxel combined with cisplatin can significantly inhibit the proliferation and migration of thyroid cancer cell line SW579.

[Key words] Paclitaxel; Cisplatin;Thyroid cancer;SW579;Proliferation;Migration

甲狀腺癌屬于一種內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，在臨床極為常見，主要為甲狀腺濾泡狀癌、乳頭狀癌，占甲狀腺癌的90%左右[1]。同時(shí)，近年來，其發(fā)病率日益提升[2]?，F(xiàn)階段，手術(shù)+放療仍然是臨床治療甲狀腺癌過程中通常采用的方法，獲取了一定的臨床療效。因此，相關(guān)學(xué)者認(rèn)為[3]，在甲狀腺癌的治療中，紫杉醇聯(lián)合順鉑也能夠促進(jìn)臨床療效的提升。紫杉醇、順鉑均屬于腫瘤化療藥物，在臨床極為常用，目前在甲狀腺癌的治療過程中得到了較為廣泛的應(yīng)用，其能夠抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死，從而發(fā)揮治療作用[4]。在甲狀腺癌等多種腫瘤中，蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路異常激活，是多種化療藥物的作用靶點(diǎn)，直接而深刻地影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[6-14]，紫杉醇聯(lián)合順鉑能夠在極大程度上促進(jìn)卵巢癌、宮頸癌治療效果的提升，同時(shí)，通過AKT信號(hào)通路途徑，紫杉醇、順鉑均能夠發(fā)揮抗癌作用。本研究探討了紫杉醇聯(lián)合順鉑對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞SW579增殖、遷移的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器? 采用日本Nikon公司生產(chǎn)的Eclipse TS100倒置光學(xué)顯微鏡，美國Thermo Scientific公司生產(chǎn)的Forma Class II生物安全柜，美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)，美國Eppendorf公司生產(chǎn)的5417R離心機(jī)。

1.1.2 藥品及試劑? 應(yīng)用中國食品藥品檢定研究所提供的紫杉醇（批號(hào)：10382-201102，純度：99.6%）、順鉑（批號(hào)：100401-201302，純度：99.8%），美國Sigma公司生產(chǎn)的MTT，江蘇南通碧云天生物技術(shù)研究所提供的細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、山羊抗兔IgG（H+L，辣根過氧化物酶標(biāo)記）、山羊抗小鼠IgG（H+L，辣根過氧化物酶標(biāo)記）、兔抗GADPH單克隆抗體、二辛可酸（BCA）蛋白定量試劑盒、ECL超敏發(fā)光液，美國Epitmics公司生產(chǎn)的AKT、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗體、磷酸酶及張力蛋白同源基因（兔抗人第10號(hào)染色體缺失，PTEN），美國CST公司生產(chǎn)的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9單克隆抗體、p27、兔抗細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1），美國Corning公司生產(chǎn)的Transwell小室，美國Gibco公司生產(chǎn)的胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清。

1.1.3 細(xì)胞? 運(yùn)用中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供的甲狀腺癌細(xì)胞SW579。

1.2 方法

1.2.1 分組和給藥? 在DMEM培養(yǎng)液（含15%胎牛血清）中加入細(xì)胞，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，到80%左右融合后分為試驗(yàn)組、空白對(duì)照組（只含DMEM培養(yǎng)基），試驗(yàn)組又分為3 μmol/L紫杉醇組（紫杉醇組）、30 μmol/L順鉑組（順鉑組）、3 μmol/L紫杉醇+30 μmol/L順鉑聯(lián)合用藥組（聯(lián)合用藥組）。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)活力? 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，在此過程中充分利用2.5%胰酶溶液，將細(xì)胞密度調(diào)整到4×103/mL，在96孔板上接種，每孔200 μL，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，給藥后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 d，加入20 μL 5 mg/mL MTT，培養(yǎng)4 h后棄上清，加入150 μL二甲基亞砜，待充分溶解結(jié)晶后，在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定光密度（OD570值），按試驗(yàn)組與空白對(duì)照組OD570之比的方法，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。

1.2.3 流式細(xì)胞數(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期? 用2.5%胰酶溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，將細(xì)胞密度調(diào)整為8×103/mL，在6孔板中接種，每孔1 mL，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，給藥后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 d，然后收集細(xì)胞，用75%乙醇將其固定，在4℃溫度下放置2 d。離心10 min，速率為3000 r/min，離心半徑為15 cm，棄去乙醇，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，加入5 μL 10 mg/mL核糖核酸酶（RNAse），放置在37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1 h，再加入100 μg/mL碘化丙啶（PI）染液，室溫下進(jìn)行避光染色30 min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA含量，采用FACSort Cell Quest軟件分析細(xì)胞周期并檢測(cè)細(xì)胞凋亡，之后進(jìn)行DNA分析。

1.2.4? 細(xì)胞遷移試驗(yàn)? 培養(yǎng)和收集細(xì)胞方法同上。然后在Transwell小室的上室加入細(xì)胞消化，將DMEM培養(yǎng)液（含5%胎牛血清）應(yīng)用于下室，繼續(xù)培養(yǎng)1 d。取出Transwell小室，分別應(yīng)用PBS、多聚甲醛、結(jié)晶紫洗滌、固定、染色。在100倍倒置光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選出5個(gè)視野的計(jì)數(shù)細(xì)胞，然后計(jì)算出從濾膜穿過向下室進(jìn)入的細(xì)胞數(shù)，即平均每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，表示細(xì)胞的遷移能力。

1.2.5 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)? 在Transwell小室的微膜上均勻平鋪基質(zhì)膠（Matrigel），制作凝膠備用。計(jì)算從濾膜穿過向下室進(jìn)入的細(xì)胞數(shù)，用每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞的侵襲能力。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)? 接種、培養(yǎng)、收集細(xì)胞、給藥方法同上。然后加入RIPA裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，離心10 min，速率設(shè)定為10000 r/min，離心半徑為15 cm，收集沉淀，獲取總蛋白。經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后濕法轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，分別在一抗中浸入膜，在4℃溫度下孵育過夜。漂洗后加入二抗中，在室溫下進(jìn)行1～2 h孵育。一抗、二抗稀釋比例分別為1：100、1：500，漂洗過程中充分利用三羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液（TBST）。取出膜后漂洗，漂洗過程中充分利用PBS，將增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液滴加在膜上，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。采用Quantity One軟件，統(tǒng)計(jì)各蛋白灰度值。將AKT的磷酸化水平用p-AKT和AKT灰度值的比值表示，將相應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)量用MMP-2、MMP-9、p27、Cyclin D1、PTEN和內(nèi)參GADPH灰度值的比值表示，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察各組細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移、侵襲能力。同時(shí)，記錄各組細(xì)胞AKT信號(hào)通路、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、細(xì)胞MMP表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移、侵襲能力比較

聯(lián)合用藥組細(xì)胞活力、細(xì)胞周期S、G2、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲能力均顯著低于順鉑組、紫杉醇組、空白對(duì)照組（P<0.05），細(xì)胞周期G1顯著高于順鉑組、紫杉醇組、空白對(duì)照組（P<0.05）。順鉑組、紫杉醇組細(xì)胞活力、細(xì)胞周期S、G2、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲能力均顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05），細(xì)胞周期G1均顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），但順鉑組、紫杉醇組細(xì)胞活力、細(xì)胞周期G1、S、G2、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲能力之間的差異均不顯著（P>0.05），見表1。

2.2 各組細(xì)胞AKT信號(hào)通路、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、細(xì)胞MMP表達(dá)比較

聯(lián)合用藥組PTEN/GADPH、P27/GADPH表達(dá)均顯著高于順鉑組、紫杉醇組、空白對(duì)照組（P<0.05），P-AKT/AKT、CyclinD1/GADPH、MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH表達(dá)均顯著低于順鉑組、紫杉醇組、空白對(duì)照組（P<0.05），順鉑組、紫杉醇組PTEN/GADPH、P27/GADPH表達(dá)均顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），P-AKT/AKT、CyclinD1/GADPH、MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH表達(dá)均顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05），但順鉑組、紫杉醇組PTEN/GADPH、P-AKT/AKT、P27/GADPH、CyclinD1/GADPH、MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH表達(dá)之間的差異均不顯著（P>0.05）。見表2。

3討論

本研究結(jié)果表明，聯(lián)合用藥組細(xì)胞活力、細(xì)胞周期S、G2、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲能力均顯著低于順鉑組、紫杉醇組、空白對(duì)照組（P<0.05），細(xì)胞周期G1顯著高于順鉑組、紫杉醇組、空白對(duì)照組（P<0.05），順鉑組、紫杉醇組細(xì)胞活力、細(xì)胞周期S、G2、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲能力均顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05），細(xì)胞周期G1均顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），但順鉑組、紫杉醇組細(xì)胞活力、細(xì)胞周期G1、S、G2、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲能力之間的差異均不顯著（P>0.05），為紫杉醇聯(lián)合順鉑化療治療甲狀腺癌提供了依據(jù)。紫杉醇和順鉑能夠使細(xì)胞周期在G1期或G2/M期停滯，將其設(shè)定為靶點(diǎn)，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制，類似于大部分抗腫瘤藥物。

P27能夠發(fā)揮轉(zhuǎn)譯后修飾作用，能夠?qū)?xì)胞從G1期到S期的過程進(jìn)行干預(yù)，負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期。相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者在1991年從甲狀腺癌腺瘤中發(fā)現(xiàn)了CyclinD1基因。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究[5]表明，CyclinD1過表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞周期G1期的縮短，為細(xì)胞向S期進(jìn)入提供良好的前提條件，最終造成細(xì)胞過度增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。在甲狀腺乳頭狀癌中，CyclinD1顯著過表達(dá)，同時(shí)直接影響腫瘤轉(zhuǎn)移、預(yù)后。從這里可以看出，將甲狀腺癌細(xì)胞中CyclinD1下調(diào)、p27上調(diào)能夠阻滯癌細(xì)胞增殖。

在甲狀腺癌患者的預(yù)后影響因素中，惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要作用，在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中，細(xì)胞外基質(zhì)降解是必要步驟，而在細(xì)胞外基質(zhì)降解中，MMPs是最重要的一組蛋白酶，在細(xì)胞腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了極為重要的作用。在甲狀腺瘤惡性進(jìn)展或轉(zhuǎn)移過程中，MMP-2、MMP-9發(fā)揮著極為重要的作用，同時(shí)過表達(dá)于惡性甲狀腺癌組織中。因此，通過干擾MMPs的表達(dá)，在一定程度上抑制甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。

多條信號(hào)通路的調(diào)節(jié)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮著極為重要的作用，在甲狀腺癌的發(fā)生過程中，P13K/AKT異常激活發(fā)揮著極為重要的作用，通過調(diào)節(jié)該信號(hào)通路能夠在極大程度上對(duì)甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展造成影響。PTEN基因能夠使細(xì)胞停止分裂，進(jìn)入細(xì)胞凋亡，從而阻止不受控制的細(xì)胞增殖，進(jìn)而抑制腫瘤形成。PTEN的過度表達(dá)能夠?qū)KT活性下調(diào)，從而將p27表達(dá)上調(diào)，將Cyclin D1表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而造成細(xì)胞周期停滯。PTEN缺失組織會(huì)向腫瘤演變，因此，將PTEN表達(dá)上調(diào)、將AKT活性下調(diào)能夠在極大程度上對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制。

相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[15-20]，紫杉醇聯(lián)合順鉑可能通過將p27、PTEN表達(dá)上調(diào)，使MMP-2、MMP-9、Cyclin D1表達(dá)下調(diào)，對(duì)AKT磷酸化進(jìn)行抑制增強(qiáng)甲狀腺癌細(xì)胞SW579增殖、遷移、侵襲的抑制作用。本研究結(jié)果表明，聯(lián)合用藥組PTEN/GADPH、P27/GADPH表達(dá)均顯著高于順鉑組、紫杉醇組、空白對(duì)照組（P<0.05），P-AKT/AKT、CyclinD1/GADPH、MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH表達(dá)均顯著低于順鉑組、紫杉醇組、空白對(duì)照組（P<0.05），順鉑組、紫杉醇組PTEN/GADPH、P27/GADPH表達(dá)均顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），P-AKT/AKT、CyclinD1/GADPH、MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH表達(dá)均顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05），但順鉑組、紫杉醇組PTEN/GADPH、P-AKT/AKT、P27/GADPH、CyclinD1/GADPH、MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH表達(dá)之間的差異均不顯著（P>0.05），與上述相關(guān)醫(yī)學(xué)研究結(jié)果一致，說明在甲狀腺癌治療中，紫杉醇聯(lián)合順鉑治療效果優(yōu)于單獨(dú)治療組，其對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖造成影響的機(jī)制可能為通過PTEN/AKT信號(hào)通路。

總之，紫杉醇聯(lián)合順鉑能夠顯著抑制甲狀腺癌細(xì)胞SW579增殖、遷移，值得在臨床上推廣。但是，本研究存在不足之處，表現(xiàn)在具有較少的樣本量、較短的治療時(shí)間，沒有追蹤遠(yuǎn)期療效，造成研究結(jié)果可能存在偏差，今后臨床應(yīng)該擴(kuò)大樣本量，延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，進(jìn)一步深入細(xì)致的研究。

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