劉長彬，盧春霞，楊 華，張云生，石國慶1，*

(1.石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832003； 2.新疆農(nóng)墾科學院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000；3.長江師范學院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學院，重慶 408100)

【研究意義】妊娠相關糖蛋白 (Pregnancy-associated glycoproteins，PAG) 是偶蹄類動物胎兒胎盤滋養(yǎng)層細胞合成、分泌的一類糖蛋白。1991年Zoli 等[1]從奶牛胎盤中分離得到分子量為67 kDa的糖蛋白，等電點為4.4、4.6、5.2和5.4，與Butler等[2]發(fā)現(xiàn)的妊娠特異性蛋白 B (PSPB)有著高度的相似性，構(gòu)成了一個龐大的胎盤糖蛋白家族，統(tǒng)稱PAG。PAG屬于天冬氨酸蛋白酶家族，與胃蛋白酶、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E有50 %以上的相同氨基酸序列，但大多數(shù)PAG由于催化位點氨基酸發(fā)生置換使其沒有酶活性。目前，牛妊娠相關糖蛋白(bPAG)基因家族至少有 22 個轉(zhuǎn)錄本以及變異體，根據(jù)其出現(xiàn)的時間，將其分為兩組：“古代組”與“現(xiàn)代組”，大多數(shù) PAG屬于“現(xiàn)代組”，由胎盤滋養(yǎng)外胚層的雙核細胞表達產(chǎn)生，后經(jīng)雙核細胞遷移而進入血液，而“古代組”PAG 則在整個滋養(yǎng)外胚層細胞中產(chǎn)生[3-5]。另外，不同bPAG在妊娠期內(nèi)的表達水平和表達時間有明顯區(qū)別[5-7]?！厩叭搜芯窟M展】在bPAG家族中，bPAG1在母畜懷孕后不久就能外周血中檢測到，并在整個孕期持續(xù)存在，常作為一種標志物用于家畜早期妊娠診斷[8-10]。目前，PAGs 商業(yè)化檢測試劑盒在國外已經(jīng)得到廣泛的應用，并取得較高的準確率[11-12]，但高的檢測成本(每頭次約33元)使其在國內(nèi)無法大規(guī)模推廣應用。而國內(nèi)關于PAG的研究報道極少，且無商品化的PAG抗原銷售，進而限制了PAG快速檢測方法的研發(fā)及應用。因此，如何獲取高純度的PAG蛋白，是制備PAG抗體和研發(fā)快速檢測產(chǎn)品的基礎，是解決生產(chǎn)中實際問題的關鍵環(huán)節(jié)?！颈狙芯壳腥朦c】目前，前人多采用磷酸鉀緩沖液提取、飽和硫酸銨沉淀、離子交換層析等傳統(tǒng)方法從母畜胎盤子葉中分離純化天然PAG蛋白[1,13-14]，但步驟繁瑣復雜，且在純化過程中稍有不慎容易導致蛋白降解。雖然有研究者利用豌豆、扁豆、紫藤花凝集素[15-17]以及胃蛋白酶抑制劑[18-19]特異性結(jié)合PAG，通過親和層析法獲得PAG，但該法成本較高，不利于PAG的大量純化。而體外重組蛋白技術為PAG結(jié)構(gòu)、功能和應用研究提供了新思路[20-21]。目前，國內(nèi)關于bPAG1重組蛋白的研究鮮有報道?！緮M解決的關鍵問題】基于此，本研究對bPAG1密碼子進行優(yōu)化，通過全基因合成法得到bPAG1基因序列，然后構(gòu)建PCDNA3.1 (-)-bPAG1真核表達載體，在中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)細胞中誘導表達并產(chǎn)生重組bPAG1，為奶牛早期妊娠診斷產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CHO細胞株由本實驗室保存；PCDNA3.1 (-)載體購自美國Invitrogen公司；TOP10感受態(tài)細胞、小鼠抗6× His單克隆抗體、DNA mark、TaqDNA 聚合酶、Pfu DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶、EcoRI 內(nèi)切酶、HindIII 內(nèi)切酶、脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑、動物細胞蛋白裂解液、Ni-IDA 蛋白純化試劑盒、DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒、SDS-PAGR變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒、柱式質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒等購自生工生物工程(上海)股份有限公司。PVDF膜購自美國Millipore公司；Expi293TMExpression Medium 購自上海北諾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

VeritiTM96梯度PCR儀(美國ABI)；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD)；Essential V4凝膠成像系統(tǒng)(英國UVITEC)；Powerpac 300電泳儀(美國BIO-RAD)；DYCZ-24EN雙垂直電泳槽(北京六一儀器廠)，DYCP-31BN瓊脂糖水平電泳槽(北京六一儀器廠)；Thermo311 CO2培養(yǎng)箱(美國熱電公司)；Thermo ScientificTMVarioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(美國賽默飛)；轉(zhuǎn)膜儀(美國Invitrogen公司)；WD-9405A型脫色搖床(北京六一儀器廠)；5424R臺式冷凍離心機(德國eppendorf公司)；BSC-150 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海博訊事業(yè)有限公司)；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(成都超純科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 bPAG1基因優(yōu)化與合成 根據(jù)Genbank公布的bPAG1(登錄號：M73962)核苷酸序列，以及宿主細胞的對密碼子的偏好性，對bPAG1密碼子進行優(yōu)化，并在優(yōu)化序列的5’端設計EcoRI位點，3’端設計HindIII酶切位點和His-Flag 標簽，優(yōu)化的基因序列見3.1。根據(jù)優(yōu)化后的bPAG1核苷酸序列，應用 primer premier軟件設計54對引物(其余52對引物未列出)，上游引物1：GACACGAATTCGCCACCATGCCCCTGCTTCTTTTGCT，下游引物54：GTGTCAAGCTTCTATTTATCGTC(下劃線分別分為EcoRI 和HindIII酶切位點)，然后采用全基因合成法獲得目的產(chǎn)物，bPAG1全基因合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測， DNA 凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.3.2 重組載體PCDNA3.1(-)-bPAG1的構(gòu)建 用EcoRI和HindIII限制性內(nèi)切酶將回收的PCR產(chǎn)物和PCDNA3.1(-)載體進行雙酶切。PCR產(chǎn)物酶切體系：純化回收的片段1 μg (20 μl)，10×FD Buffer 5 μl，EcoRI 1 μl (10 U/μl)，HindIII 1 μl (10 U/μl)，ddH2O加至50 μl。PCDNA3.1-載體酶切體系：PCDNA3.1(-)載體1 μg， 10× FD Buffer 5 μl，EcoRI 1 μl (10 U/μl)，HindIII 1 μl (10 U/μl)，ddH2O 加至50 μl，以上體系分別37 ℃酶切2 h。2種酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用膠回收試劑盒回收。將回收的酶切產(chǎn)物用T4連接酶在22 ℃連接2 h。連接體系為：目的片段8 μl，酶切空載體4 μl， T4DNA Ligase 1 μl (5 U/μl)，10×T4DNA Ligase buffer 2 μl，ddH2O 加至20 μl。

1.3.3 重組載體PCDNA3.1(-)-bPAG1的轉(zhuǎn)化、篩選與鑒定 將10 μl連接產(chǎn)物加入到50 μl的TOP10F'感受態(tài)細胞中，混勻，冰浴 10 min。42 ℃熱激 45 s，冰浴 5 min。加入 800 μl LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 搖菌培養(yǎng)45 min。取20 μl菌液涂到Amp+/LB 固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng) 14 h。挑取單個菌落接種到Amp+/LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌培養(yǎng)6 h，采用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，以其為模板進行PCR鑒定。PCR反應體系：上游引物1 1 μl，下游引物54 1 μl，模板 3 μl，TaqDNA聚合酶 1 μl (10 U/μl)，dNTP 1 μl, 10× PCR buffer 5 μl，ddH2O補齊至50 μl。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min， 95 ℃變性22 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。并對提取的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。將得到的陽性轉(zhuǎn)化子送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，經(jīng)測序驗證插入序列正確無誤后，進行質(zhì)粒大量抽提，保存至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 重組質(zhì)粒PCDNA3.1(-)-bPAG1的誘導表達 rbPAG1的誘導表達參考Patel的方法[22]，并稍作修改。將CHO細胞接種于含6 mM L-glutamine的Expi293TM培養(yǎng)基中，使細胞濃度達到106cells/mL，37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)過夜。將100 μg重組質(zhì)粒取和200 μl轉(zhuǎn)染試劑加入至20 mL Expi293TM培養(yǎng)基中，渦旋混勻，室溫孵育10 min。然后將混合液加入至上述CHO培養(yǎng)物中，37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)4 d，收集表達上清，1000 r/min離心5 min，過0.22 μm濾膜。

1.3.5 重組蛋白的純化 收集CHO培養(yǎng)液上清，采用Ni柱親和層析法純化目的蛋白。首先使用含10 mM的Binding buffer以1 mL/min的流速平衡Ni柱，將上清與Binding buffer混合，上樣，用兩倍柱體積的Binding buffer沖洗Ni柱直至紫外回復至基線處，除去雜蛋白，然后采用含不同濃度的咪唑(10、40、80、250、500 mM)洗脫溶液進行梯度洗脫，將上清液、流穿液、洗脫液進行 SDS-PAGE電泳，通過考馬斯亮藍染色檢測純化效果。同時采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。

1.3.6 重組蛋白的Western blot鑒定 純化后的rbPAG1經(jīng)SDS-PAGE電泳后，取下凝膠，采用半干式電轉(zhuǎn)印法將rbPAG1轉(zhuǎn)至PVDF膜上。PVDF 膜使用之前在中甲醇中浸泡 30 s，之后將 PVDF 膜、凝膠、濾紙置于轉(zhuǎn)膜液浸泡，浸泡后將三者按照正確順序放在轉(zhuǎn)印儀上，轉(zhuǎn)印 45 min。取下 PVDF 膜于 5 %脫脂奶粉中，室溫封閉2 h。用1×PBST漂洗3～4次，每次5 min。加入1∶2000 稀釋的抗 His 標簽小鼠單克隆抗體，室溫孵育1 h，用1×PBST漂洗3～4次，每次5 min。最后用ECL發(fā)光底物，拍照。

圖1 bPAG1基因PCR擴增電泳圖Fig.1 The electropherogram of PCR products of bPAG1 gene

2 結(jié)果與分析

2.1 bPAG-1基因 PCR擴增與鑒定

Genbank(登錄號：M73962)公布的bPAG-1基因全長為1295 bp，蛋白編碼區(qū)(Coding sequence, CDS)長度為1143 bp，包含9個外顯子和8個內(nèi)含子[23]，根據(jù)宿主細胞對密碼子的偏好性，優(yōu)化后的bPAG-1基因序列全長1218 bp，基因序列：GAATTCGCCACCATGCCCCTGC TTCTTTTGCT GCCACTGCTC TGGGCCGGGG CCCTGGCCAT CGTGAAGATT CCCCTGAGAA GACTTAAGAC AATGAGAAAT GTGGTGAGTG GGAAAAACAT GCTTAACAAC TTTCTCAAGG AGCACGCCTA CAGCCTGTCT CAAATTTCTT TCCGCGGGTC AAACCTGACA ACACATCCCC TGCGCAACAT CAAGGATCTG GTGTATATGG GGAACATTAC CATCGGGACA CCCCCACAGG AGTTTCAGGT GGTCTTCGAT ACTGCCTCAA GTGATCTCTG GGTGCCCAGC GATTTCTGTA CCAGCCCCGC TTGCAGCACC CATGTGCGGT TTAGACACCT GCAGAGCAGC ACCTTTAGGC TGACAAATAA GACTTTCCGG ATCACCTATG GGTCCGGAAG AATGAAAGGG GTCGTGGTGC ACGACACCGT GCGGATCGGA AACCTGGTGA GTACTGATCA GCCCTTCGGA CTGAGCATCG AGGAATACGG GTTTGAGGGA CGCATCTACG ATGGGGTGCT GGGATTGAAC TACCCCAACA TTTCCTTTTC CGGGGCAATT CCTATCTTCG ATAAGCTCAA AAACCAGAGG GCCATTTCCG AACCTGTCTT CGCCTTTTAC CTGAGCAAGG ACGAGAGGGA GGGCTCCGTC GTGATGTTTG GCGGCGTCGA TCATCGGTAC TACGAGGGCG AACTCAACTG GGTCCCCCTC ATCCAGGCCG GGGACTGGTC CGTGCACATG GACCGGATCT CCATTGAGCG GAAGATTATC GCCTGCTCCG ACGGCTGCAA GGCTCTCGTG GACACTGGAA CTAGCGATAT TGTCGGGCCT AGGCGGTTGG TGAACAACAT TCACCGGCTC ATCGGGGCCA TTCCAAGGGG CTCCGAGCAC TACGTCCCAT GCAGCGAGGT CAACACCTTG CCAAGCATTG TCTTCACAAT CAACGGCATC AACTACCCTG TCCCTGGCCG GGCATACATT TTGAAGGACG ATCGGGGCAG GTGCTACACA ACATTCCAGG AGAACAGGGT GAGCTCATCT ACCGAGACAT GGTACCTGGG CGACGTGTTC CTGAGACTCT ACTTTTCCGT GTTCGACAGG GGCAACGACA GGATCGGCTT GGCCAGGGCT GTGCTGGAGCATCACCATCACCATCACCATCACGACTACAAAGATGACGACGATAAATAGAAGCTT。下劃線分別分為EcoRI 和HindIII酶切位點，5’端斜體為Kozak序列，3’端斜體為His-Flag標簽位點，粗體為連接目的蛋白和His標簽的Linker序列。圖1電泳結(jié)果表明，PCR成功擴增出帶有酶切位點的目的基因bPAG1，片段大小約1218 bp，與預期值一致。

2.2 重組質(zhì)粒PCDNA3.1-bPAG1的構(gòu)建及鑒定

重組載體轉(zhuǎn)化后，隨機挑選8個單菌落進行PCR 鑒定，電泳結(jié)果(圖2)顯示，泳道 1～8 在1218 bp 左右均出現(xiàn)與預期大小相同的目的條帶，表明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài) TOP10。重組質(zhì)粒雙酶切后，在 5400和1218 bp處各有1條清晰條帶(圖3)，分別為PCDNA3.1 (-)載體和bPAG1基因，與預期結(jié)果相符，表明重組載體構(gòu)建成功。將測序結(jié)果與優(yōu)化后的bPAG1基因?qū)Ρ确治?，堿基序列完全一致，符合率為100 %，其編碼的氨基酸與Genbank (protein ID：AAB53145)公布的完全一致，表明bPAG1插入片段完全正確，未發(fā)生任何堿基突變。

圖2 陽性克隆PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of cloning products amplified by PCR

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of recombinant plasmid by enzymatic digestion

2.3 重組蛋白的表達純化

重組表達載體上帶有6× His標簽，將誘導表達的CHO細胞上清經(jīng)Ni-IDA 蛋白純化試劑盒進行親和層析，隨后利用SDS-PAGE對純化的蛋白進行檢測，結(jié)果顯示(圖4)，250 mM的咪唑洗脫溶液可獲得純度較高的bPAG1重組蛋白，相對分子質(zhì)量約62 kDa。而bPAG1基因CDS長度為1143 bp，編碼380個氨基酸殘基(amino acid, AA)，信號肽別區(qū)域位于第1～15位氨基酸殘基，其分子式為C1925H3002N532O550S14，預測蛋白質(zhì)分子量為 42.8 kDa，等電點8.98。根據(jù)實驗結(jié)果可知，實際所得rbPAG1分子質(zhì)量大于預期值，推測rbPAG1在表達過程中存在糖基化修飾，因為有研究表明bPAG1的氨基酸序列存在4個N-糖基化位點，導致其在翻譯修飾后分子量幾乎增加1倍[24]。Gel-Pro Analyzer灰度分析結(jié)果表明，純化后的rbPAG1純度達88 %。經(jīng)BCA方法檢測，純化rbPAG1濃度為0.3 mg/mL。

M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準; 1: BSA; 2: 上樣液; 3: 流出液; 4: 10 mM咪唑洗脫液; 5～7: 40 mM咪唑洗脫液; 8: 80 mM咪唑洗脫液; 9～10: 250mM咪唑洗脫液; 11～13: 500mM咪唑洗脫液 M: Protein marker; 1: BSA; 2: Loading; 3: Effluent; 4: Eluent of 10 mM imidazole; 5-7: Eluent of 40 mM imidazole; 8: Eluent of 80 mM imidazole; 9-10: Eluent of 250 mM imidazole; 11-13: Eluent of 500 mM imidazole圖4 SDS-PAGE分析rbPAG1純化效果Fig.4 SDS-PAGE analysis of rbPAG1

P1、P2：帶His標簽的陽性樣本; 3, 4: 純化后的rbPAG1(蛋白濃度0.3 mg/mL); M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準P1, P2: Positive controls; 3, 4: Purified rbPAG1 (0.3mg/mL); M: Protein marker圖5 rbPAG1的 Western blot鑒定Fig.5 Western blotting analysis of rbPAG1

2.4 重組蛋白的Western blot鑒定

純化的重組蛋白C 端包含一個His 標簽，根據(jù)這一特性，利用 His標簽抗體對rbPAG1重組蛋白進行Western blot檢測(圖5)。約在62 kDa 處有特異性雜交條帶，與SDS-PAGE結(jié)果一致，說明rbPAG1在真核表達系統(tǒng)中誘導表達成功。

3 討 論

牛妊娠相關糖蛋白 (bPAG) 種類繁多，人們利用RT-PCR技術從牛胎盤組織中篩選出了至少22種 PAG cDNA轉(zhuǎn)錄本， “古代組”PAG出現(xiàn)在8000萬年前，經(jīng)過進化在約5000萬年前出現(xiàn)“現(xiàn)代組”PAG[4]。 大多數(shù) bPAG如bPAG-1、3、4、5、6、7、9、14、15、16、17、18、19、20、21、22屬于“現(xiàn)代組”，由于催化中心堿基發(fā)生了突變而不具有酶活性；而bPAG-2、8、10、11、12、13基因?qū)儆凇肮糯M”，在整個滋養(yǎng)外胚層細胞中產(chǎn)生，保留了典型天冬氨酸肽酶的所有特征，具有酶活性[3, 5-6]。由于bPAG家庭成員間的序列差異，bPAG基因在整個妊娠期的表達和分泌呈現(xiàn)時空特異性[3, 5-6, 25]，如Green運用核糖核酸酶保護實驗檢測胎盤中RNA的表達，發(fā)現(xiàn)bPAG-2、4、5、8、9、10、11 早在妊娠后 25 d 就已經(jīng)表達，而bPAG-1、6、7在妊娠后 45 d開始表達，主要存在于妊娠中后期[3]。

由于bPAGs 蛋白種類繁多，增加了對其結(jié)構(gòu)和功能研究的難度，體外重組蛋白的出現(xiàn)為探究一類蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供了新思路。因此，前人對 bPAGs 在真核系統(tǒng)中的表達做了相關研究，Patel 等[22](2004)構(gòu)建真核表達載體 PAG-pRcRSV，分別在HEK 293和CHO細胞中首次表達了PAG1重組蛋白，但表達量較低。2010年，Telugu 等[26]為驗證“古代組”bPAG基因是否具有酶活性，利用昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)中成功表達了bPAG2 和 bPAG12重組蛋白，并對這兩種蛋白的蛋白水解活性進行研究，結(jié)果顯示兩個重組蛋白具有良好的蛋白水解活性。本研究為提高bPAG1在真核系統(tǒng)中的表達量，采用基因優(yōu)化方法在不改變氨基酸序列的前提下，通過消除稀有密碼子并利用偏好密碼子以及平衡GC含量等策略對bPAG1基因進行設計和優(yōu)化，然后通過全基因合成法合成了bPAG1優(yōu)化基因，并將其成功插入到真核表達載體PCDNA3.1(-)中，采用CHO細胞經(jīng)瞬時表達得到表達量及純度均較高的bPAG1重組蛋白。本研究為后續(xù)bPAG1抗體的制備和牛早期妊娠診斷產(chǎn)品的研發(fā)提供了依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究通過全基因合成法和雙酶切法將bPAG1插入到PCDNA3.1(-)表達載體中，并將重組質(zhì)粒PCDNA3.1(-)-bPAG1轉(zhuǎn)入CHO細胞，經(jīng)過Ni柱親和層析獲得分子質(zhì)量約為62 kDa的bPAG1重組蛋白，為bPAG1單克隆抗體的制備和快速檢測方法的研發(fā)奠定了基礎。