唐 琴，孫威江,,*，陳志丹*，沈詩鈺，周 喆，陳佳佳，陳翠翠

（1.福建農(nóng)林大學園藝學院，福建 福州 350002；2.福建省安溪縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 泉州 362400；3.福建省茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；4.福建農(nóng)林大學安溪茶學院，福建 泉州 362400）

我國是茶樹的原產(chǎn)地，栽培茶樹已有3 000余年的歷史，擁有極其豐富的茶樹種質(zhì)資源，其中野生茶樹是一類較為寶貴的資源，經(jīng)過長期的進化，野生茶樹蘊含著抵抗各種逆境所需的基因?？嗖枋俏覈赜械囊活惒铇滟Y源，早期多以野生茶樹形式存在并被發(fā)現(xiàn)和利用，多分布于粵、湘、贛毗鄰區(qū)，尤其以南嶺山脈兩側(cè)最多[1]。苦茶通常具有較為獨特的品質(zhì)風味和保健功效。近年來針對苦茶資源挖掘和產(chǎn)品開發(fā)的研究也日漸增多，研究較多的有江華苦茶[2-3]和以苦茶堿為優(yōu)勢嘌呤堿的苦茶（Camellia assamica var. kucha Chang et Wang）[4]，從理化分析到分子生物技術(shù)等均有涉及，闡述了苦茶的獨特性及其相應的形成機理[5]。福建蘊含豐富的特異性苦茶茶樹種質(zhì)資源，尤溪苦茶便是其中一類優(yōu)質(zhì)資源，距今已有200多年栽培生產(chǎn)歷史。尤溪苦茶生長地區(qū)年均氣溫為15.5～16 ℃，日均最高氣溫僅23.5 ℃，海拔600～1 000 m，相對濕度84%以上。尤溪苦茶群體資源生長于當?shù)睾瑤r石碎屑的肥沃土壤中，四周植被資源豐富。發(fā)芽期較晚，一般在4月中旬，樹型以灌木為主，少數(shù)為小喬木，樹姿較直立，葉片形態(tài)為披針或長橢圓大葉，葉劇尖，葉緣有鋸齒，芽頭大多為紫色[6]，耐寒力、抗凍性等抗逆能力強，滋味苦、略澀、回甘，是當?shù)貍鹘y(tǒng)民間藥茶，具有重要的研究與保護價值[7]。

茶葉中苦澀味物質(zhì)主要有茶多酚、兒茶素、花青素、生物堿、茶皂素和氨基酸形成的復合物等[8]。兒茶素中以酯型兒茶素含量最為豐富，呈苦澀味，且苦味比澀味強，花青素是紫芽茶苦澀味的主要影響物質(zhì)；茶葉中生物堿主要有咖啡堿、可可堿和茶堿，是茶葉中主要的苦味物質(zhì)；茶皂素味苦而辛辣，除此之外少部分的黃酮類物質(zhì)也具有明顯的苦味，茶葉苦味是多種物質(zhì)共同作用的結(jié)果[9-11]。由于苦茶的獨特性及其藥用價值而受到越來越多生產(chǎn)企業(yè)和研究單位的關(guān)注，本研究從尤溪苦茶群體資源中采集33 株茶樹資源對其苦澀物質(zhì)及功能成分分析研究，探明引起苦澀味的功能物質(zhì)成分，為尤溪苦茶的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集福建省尤溪縣33 株長勢好，持嫩性強的尤溪苦茶單株茶樹的一芽二葉鮮葉，編號分別為CMC01～CMC33，以福云六號、福鼎大白、黃旦和鐵觀音為對照，參照文獻[12]的方法，采用烘干固樣法制成樣品，保存于冰箱待測。

咖啡堿、可可堿、茶葉堿、沒食子酸（gallate，GA）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechingallicacid，EGCG）和兒茶素（catechin，C）標樣（純度≥98%）美國Sigma公司；表兒茶素（epicatechin，EC）、表兒茶素沒食子酸（epicatechingallate，ECG）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、兒茶素沒食子酸（catechingallate，CG）、沒食子兒茶素沒食子酸（gallocatechingallate，GCG）標樣（純度≥98%） 成都德思特生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜級） 德國Merck公司；甲酸（色譜級，純度≥98%） 美國Aladdin公司；水為超純水，其他試劑為市售分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀、2998型二極管陣列檢測器、X-select-T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）美國Waters公司；TU-1810PC紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；FA1004型電子天平、MA150C-000230V1快速水分測定儀 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；STARTER 3100 pH計 奧豪斯儀器（上海）有限公司；UNIQUE-R20純水系統(tǒng) 廈門銳思捷科學儀器有限公司；HWS26型電熱恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司；SB-5200DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；PULVERISETTE23微型研磨 德國飛馳儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素、可溶性糖和黃酮成分測定

花青素含量的測定參照周瓊瓊[13]和Pang Yongzhen[14]等方法提取花青素測定液進行測定并計算；可溶性總糖測定參照蒽酮比色法?？傸S酮含量測定參照AlCl3比色法。實驗設(shè)3 次重復，取平均值。

1.3.2 兒茶素組分和咖啡堿測定

采用高效液相色譜法，參照彭靜等[15]的方法；咖啡堿前處理參照GB/T 8312—2013《茶咖啡堿測定》，兒茶素前處理參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測方法》，設(shè)置3 次重復，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

酯型兒茶素總量=ECG+EGCG+GCG+CG；非酯型兒茶素（簡單兒茶素）總量=C+EC+EGC+GC；兒茶素品質(zhì)指數(shù)=（EGCG+ECG）×100/EGC[16]。數(shù)據(jù)分析采用Excel進行統(tǒng)計，采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并用Origin 2017軟件繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 尤溪苦茶資源主要苦澀味物質(zhì)成分分析

通過對33 份尤溪苦茶資源的主要苦澀味物質(zhì)進行基本的統(tǒng)計分析，3 個生物堿組分和9 個兒茶素組分標準品液相色譜圖如圖1所示，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。尤溪苦茶主要苦澀味物質(zhì)含量均具有一定差異，20 個指標變異系數(shù)在9.74%～73.08%之間，以GCG差異最大，EGCG最小，除EGCG外其余變異系數(shù)均大于10%，其中，花青素、可可堿、茶堿、生物堿總量以及除EGCG外兒茶素各組分的變異系數(shù)均超過20%，由此可見，尤溪苦茶苦澀味物質(zhì)成分的變化幅度和變異系數(shù)均較大，遺傳多樣性豐富[17]。

表1 尤溪苦茶資源主要苦澀味成分生化統(tǒng)計分析Table 1 Statistical results of biochemical components of tea germplasm resources for Youxi bitter tea

圖1 標準品色譜圖Fig. 1 HPLC choromatograms of various standards

2.2 尤溪苦茶資源花青素與黃酮類和可溶性糖物質(zhì)成分含量分析

紫色茶樹芽葉中含量較高的花青素是其制茶苦澀味較強的主要原因之一[18]。由表1可以看出，花青素的變化幅度為0.93～3.62 mg/g，平均值為1.86 mg/g，變異系數(shù)為29.03%，花青素含量最高的單株為CMC28（3.6 2 m g/g），花青素含量最低的為C M C 2 0（0.93 mg/g），參照周喆等[19]紫化茶樹品種C18-1春季含量（2.19 mg/g），篩選出花青素特異單株8 株（CMC18、CMC21、CMC22、CMC23、CMC26、CMC28、CMC32和CMC33）。由圖2可知，與4 個對照樣相比，苦茶資源花青素含量均值高于其對照，并與黃旦差異顯著。茶葉中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，呈柔和的澀味感覺，閾值低，對茶湯苦味起增強作用，通常的味感是“苦而不甘”[20]，由表1可知，黃酮類物質(zhì)變化幅度為2.92～4.85 mg/g，平均值為3.72 mg/g，變異系數(shù)為13.17%，黃酮類物質(zhì)含量最高的為CMC13（4.85 mg/g），最低的為CMC12（2.92 mg/g），與對照相比，尤溪苦茶黃酮類物質(zhì)含量均值低于對照，差異不顯著（除黃旦）。茶鮮葉中的糖類物質(zhì)包括單糖、寡糖、多糖及其他糖類，可溶性糖是構(gòu)成茶湯甜味的主要成分，與甜度呈中度正相關(guān)[21]?？扇苄蕴沁€能緩解茶多酚和咖啡堿等物質(zhì)引起的苦澀味，增加茶湯滋味的厚味和協(xié)調(diào)性。由表1可知，尤溪苦茶可溶性糖的含量變化幅度為5.24%～9.54%，平均值為7.65%，變異系數(shù)為18.95%，含量均值低于對照，并與黃旦、鐵觀音差異顯著（圖2）。

圖2 尤溪苦茶花青素、黃酮、可溶性糖含量分析Fig. 2 Analysis of the contents of anthocyanin, flavonoid and soluble sugar in Youxi bitter tea in comparison with four control teas

2.3 尤溪苦茶資源生物堿組分含量分析

在一般茶種植物中，咖啡堿含量通常占干質(zhì)量的2%～4%，可可堿約0.05%，茶葉堿約0.002%[22]。咖啡堿是單一的苦味物質(zhì)，且閾值低，其含量與茶湯苦味呈高度正相關(guān)，可可堿和茶葉堿也呈現(xiàn)苦味，但相比咖啡堿苦味較弱[23]。由表1可以看出，尤溪苦茶中生物堿總量總變幅為3.10%～6.95%，均值為4.64%；咖啡堿總變幅為2.81%～5.49%，均值為3.98%，變異系數(shù)為15.02%，其中咖啡堿含量最高的單株為CMC24（5.49%），屬于咖啡堿含量具有特異單株[24]，含量最小的單株為CMC11（2.81%）；可可堿總變幅為0.22%～1.18%，變異系數(shù)為36.63%，均值為0.62%，其中可可堿含量最大單株為CMC24（1.18%），含量最小單株為CMC11（0.22%），茶堿總變幅為0.01%～0.08%，均值為0.05%。由表1和圖3可以看出，尤溪苦茶生物堿分布模式與茶種植物基本一致，均值含量明顯高于4 組對照，并與對照差異顯著。

圖3 尤溪苦茶生物堿組分含量分析Fig. 3 Analysis of alkaloids content in Youxi bitter tea in comparison with four control teas

2.4 尤溪苦茶資源兒茶素組分含量分析

兒茶素作為茶多酚的主體成分，與茶葉滋味品質(zhì)密切相關(guān)，分為簡單（非酯型）兒茶素和復雜（酯型）兒茶素，在兒茶素組分構(gòu)成中以酯型兒茶素為主。在茶葉中，一般含量較高的是EGCG和ECG，約占兒茶素總量的75%。兒茶素同時具有苦味和澀味，苦味相對較強，且苦澀味隨著兒茶素的濃度增強而呈線性增強，其中苦味的增強速度大于澀味[25]。其中，簡單兒茶素稍有澀味，收斂性弱，回味爽口。酯型兒茶素是茶葉苦澀味的主體，尤其是EGCG，對茶葉的苦澀起決定性的作用。兒茶素品質(zhì)指數(shù)越高，鮮葉的嫩度和茶葉品質(zhì)相對越好，特級綠茶的兒茶素品質(zhì)指數(shù)一般大于500[26]。由表1可以看出，尤溪苦茶在兒茶素組分含量配比上有差異，兒茶素組分含量中含量最高的是EGCG，含量最低的是CG，兒茶素組分含量大小的總體趨勢為EGCG＞ECG＞EGC＞GC＞C＞EC＞GCG＞CG，兒茶素總量變幅為16.44%～27.59%，平均值為22.14%，酯型兒茶素的總變幅為13.76%～20.85%，平均值為18.01%，EGCG總變幅為11.83～17.52%，平均值為15.26%，其中EGCG含量最大的單株為CMC33（17.52%），EGCG含量最低的單株為CMC25（11.83%），根據(jù)林金科等[27]特異單株的篩選標準（≥13%），尤溪苦茶基本表現(xiàn)為EGCG特異，其中含量不小于15%的特異單株有21 份。所有尤溪苦茶兒茶素品質(zhì)均大于500，說明尤溪苦茶適制綠茶，與當?shù)赜认嗖杵毡橹瞥沙辞嗑G茶的現(xiàn)狀一致[6]。

表2 尤溪苦茶資源兒茶素組分含量Table 2 Catechin contents in Youxi bitter tea leaves

由表2可知，兒茶素品質(zhì)結(jié)果顯示尤溪苦茶兒茶素指標與4 種對照茶樹各兒茶素指標均存在一定差異，尤溪苦茶中總兒茶素含量明顯高于4 種對照茶樹，但均以酯型兒茶素為主，EGCG含量最高，與王冬梅等[28]研究結(jié)果一致。其中，EGCG含量、兒茶素總量和酯型兒茶素含量均顯著高于對照，這3 類物質(zhì)均表現(xiàn)為苦澀味重，其中苦味大于澀味，進一步說明了尤溪苦茶苦味突出的原因?，F(xiàn)有研究顯示茶葉是EGCG的唯一來源，因此尤溪苦茶可作為茶樹品種改良的親本資源，也可作為直接提取EGCG的特異資源加以研究利用。

2.5 尤溪苦茶資源總體差異性成分分析

圖4 尤溪苦茶資源與對照總體差異性成分熱圖分析Fig. 4 Heat map analysis of the differential components of Youxi bitter tealeaves and control teas

為直觀地展示20 個苦澀味物質(zhì)成分在尤溪苦茶單株及對照間的差異，對所測數(shù)據(jù)進行熱圖和聚類分析，顏色偏向藍色說明含量越高。如圖4所示，茶樹品種第1聚類分為2 個大類，一類是對照樣品（黃旦、鐵觀音、福云六號和福鼎大白），一類是尤溪苦茶單株，說明尤溪苦茶與對照存在明顯的差異，主要體現(xiàn)尤溪苦茶花青素、咖啡堿、可可堿、茶葉堿、生物堿、GA、GC、EGCG、兒茶素總量和酯型兒茶素具有較高的含量，而可溶性總糖、EGC和EC含量則低于對照，進一步說明尤溪苦茶具有其獨特性，并在花青素、生物堿、EGCG、酯型兒茶素等苦澀味物質(zhì)有別于一般茶葉，是尤溪苦茶味苦味濃的內(nèi)在因子。尤溪苦茶中，CMC24獨聚一類，與其他尤溪苦茶分開，結(jié)合表1和圖4可以看出其在生物堿含量存在較為明顯的特異，具有后續(xù)尤溪苦茶特異性重要的研究價值。

3 結(jié)論與討論

3.1 尤溪苦茶的遺傳多樣性

尤溪苦茶群體資源的不同單株的主要苦澀味物質(zhì)含量均具有一定差異，20 個物質(zhì)成分指標變異系數(shù)在9.74%～73.08%之間，以GCG最大，EGCG最小，說明尤溪苦茶苦澀味生化成分存在豐富的多樣性和變異性。根據(jù)王新超等[29]對我國苦茶資源研究表明，兒茶素組分中EC和C含量以及兩者之和占總兒茶素比例能夠體現(xiàn)茶樹品種的進化程度，尤溪苦茶中EC和C的遺傳變異系數(shù)分別為41.05%和45.73%，變異類型豐富，表明參試材料既有進化比較原始的類型，也有進化較高的類型，說明尤溪苦茶具有較多樣的遺傳基礎(chǔ)。

3.2 尤溪苦茶苦味形成的生化機理

紫芽綠茶的滋味較苦澀是由于其特征成分花青素與兒茶素含量較高，咖啡堿本身呈現(xiàn)苦味，紫色芽葉苦澀味成分閾值呈咖啡堿＜花青素＜兒茶素，苦澀味指數(shù)表現(xiàn)為兒茶素＞咖啡堿＞花青素[30]。Yin Junfeng等[31]研究結(jié)果表明EGCG和咖啡堿之間具有苦味協(xié)同作用，且咖啡堿對EGCG的澀味具有增強作用。本研究結(jié)果顯示尤溪苦茶的花青素、咖啡堿、可可堿、茶堿、EGCG、兒茶素總量和酯型兒茶素含量的均值均高于對照組，解釋了尤溪苦茶苦澀味突出的原因是高含量的花青素、咖啡堿和兒茶素（特別是酯型兒茶素）以及它們的相互協(xié)同作用。研究表明尤溪苦茶可溶性糖總量的均值低于對照組，推測低含量的可溶性糖可能對尤溪苦茶苦味的產(chǎn)生起到一定的作用。研究還表明尤溪苦茶中黃酮含量均值略低于對照，因此推測黃酮物質(zhì)可能并不是導致尤溪苦茶苦味的主要原因。

3.3 尤溪苦茶特異性單株的挖掘篩選

綜合比較尤溪苦茶的苦味物質(zhì)成分，篩選出含量大于5%高咖啡堿特異性資源1 份，含量大于1%的高可可堿特異性資源1 份，含量大于15%的高EGCG資源21 份，花青素含量較高的資源8 份，可作為后續(xù)深入開展苦茶苦味形成分子調(diào)控機理以及特異性茶樹種質(zhì)資源選育和利用的重要材料。為今后的雜交育種、創(chuàng)新加工、功能性成分開發(fā)與次生代謝機理的相關(guān)研究提供良好的材料基礎(chǔ)。

3.4 尤溪苦茶資源研究與開發(fā)利用展望

近年，在相關(guān)部門和企業(yè)的重視和指導下，尤溪苦茶的獨特品質(zhì)受到了越來越多的關(guān)注，苦茶茶樹資源也得到了一定的保護，并初步開展了一些繁育、引種和茶葉試制試驗，但是尤溪苦茶這一特異性茶樹種質(zhì)還未得到系統(tǒng)保護、科學鑒定和充分利用，其特異性狀形成的機理以及利用其開發(fā)獨特功能性的茶葉產(chǎn)品的相關(guān)研究還比較缺乏。本研究收集保存了一批尤溪苦茶茶樹種質(zhì)并進行繁育，通過對尤溪苦茶的苦澀味物質(zhì)含量展開研究，闡釋尤溪苦茶苦味形成的化學機理，科學論證尤溪苦茶資源的特異性和珍稀性。在本研究的基礎(chǔ)上，今后應重點研究和探析尤溪苦茶苦澀味形成的分子機理及其調(diào)控機制，可充分結(jié)合目前快速發(fā)展的多組學分析技術(shù)，全面深入地解析尤溪苦茶資源苦澀味突出的特異機理，為開發(fā)功能性產(chǎn)品和創(chuàng)新利用尤溪苦茶資源提供科學支撐。