李鑫磊， 俞曉敏， 龔智宏， 林宏政， 郝志龍， 張 妍， 金心怡

(1.福建農林大學園藝學院；2.福建農林大學茶葉研究所；3.福建農林大學海峽聯(lián)合研究院園藝植物生物學及代謝組學研究中心；4.茶學福建省高校重點實驗室，福建福州350002)

福建省特種茶類包括綠茶、紅茶、烏龍茶和白茶[1]，不同茶類風格各異：綠茶清湯綠葉；烏龍茶綠葉紅邊，湯色金黃；紅茶紅湯紅葉；白茶白毫顯露，湯色嫩黃[2].茶樹鮮葉原料在相應茶類制作的工藝條件下，其基因表達模式、細胞結構和蛋白活性發(fā)生了改變，進而影響采后鮮葉中代謝物質的積累與轉化模式，并形成獨特的滋味、香氣和保健功效[3-5].

兒茶素是茶葉中最主要的成分之一，約占茶葉總提取物的30%～42%，其中，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）占總兒茶素的50%～80%[6].兒茶素組分在滋味上表現(xiàn)為澀和苦，其中以ECG的滋味最為強烈[7]，而EGCG的澀味閾值最低，為190 μmol·L-1[8].兒茶素組分還具有抗癌[9]和抗輻射[10]等多種保健功效，其中，酯型兒茶素EGCG和ECG較非酯型兒茶素具有更強的神經細胞保護效果[4].茶葉中也含有多種氨基酸組分，占茶葉總提取物的3%[6]，天冬氨酸、天冬酰胺和谷氨酸等氨基酸組分是茶葉中鮮甜滋味的重要來源[8]，γ-氨基丁酸在白茶中呈現(xiàn)收斂性澀味[11].其中，γ-氨基丁酸還是人腦中重要的抑制性神經遞質，與茶氨酸和谷氨酰胺一樣具有神經細胞保護作用[12].茶葉中還含有80種以上的黃酮醇或黃酮糖苷類物質[13]，占總提取物的0.5%～2.5%，在茶湯中大多表現(xiàn)為澀味，且閾值較低，其中，蘆?。ㄩ纹に?3-氧-鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷）的澀味閾值為0.00115 μmol·L-1[8].黃酮醇或黃酮糖苷類物質同樣具有神經細胞保護[14]等保健功效.咖啡堿是茶葉中最主要的嘌呤堿，占總提取物的2%～5%，咖啡堿在茶湯中表現(xiàn)為苦味，閾值為0.00122 μmol·L-1[15].咖啡堿同樣具有多種保健功效，可預防阿爾茲海默癥等神經疾病[16]等.

已有研究表明：通過非靶向代謝組學測得的由相同原料制成的綠茶、紅茶和白茶中代謝物含量分布差異較大，在主成分分析圖中分散于3個不同方向，其主要差異物質為兒茶素、氨基酸組分和黃酮糖苷類物質[17]；綠茶中的茶多酚和氨基酸總量均比其他茶類高，紅茶最低，烏龍茶和白茶介于綠茶與紅茶之間[18].但截至目前，針對相同茶葉原料制成的不同茶類中上述主要代謝產物含量差異的研究尚少，加工工序對茶葉代謝物質轉化與積累的規(guī)律尚不明確.因此，進一步探究不同茶類間主要代謝產物含量的差異，對茶葉加工工藝改良、茶葉滋味品質提升及功能性成分富集等方面具有重要作用.

福云6號和黃旦均為福建省廣泛種植的國家級優(yōu)良茶樹品種[19].福云6號常用于制作綠茶和紅茶，品質高，賣相好[20]；黃旦制成的綠茶、烏龍茶和紅茶品質俱佳[19].因此，本試驗以福云六號和黃旦茶樹品種一芽二三葉鮮葉為原料，按照綠茶、烏龍茶、紅茶和白茶的加工方法制成相應茶類，并使用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜 （ultra-high performance liquid chromatography coupled with a triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-QqQ MS）定量測定鮮葉原料和不同茶類中兒茶素組分、氨基酸組分、蘆丁和咖啡堿含量，結合相關文獻對不同加工方法引起的上述化合物含量差異形成原因進行探討.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 將25 kg福云六號和黃旦茶樹鮮葉平均分成5份，1份為鮮葉樣本，直接熱風固樣，其余4份根據(jù)不同加工方法加工為不同茶類（圖1）.試驗材料于2016年10月采自福建農林大學南山茶園，嫩度為一芽二三葉.

1.1.2 試劑 EGCG、EGC、兒茶素（C）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表兒茶素（EC）、沒食子兒茶素（GC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、茶氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸、γ-氨基丁酸、蘆?。兌取?5%）、乙腈（質譜級）、甲醇（液相色譜級）和甲酸（98%）購自美國Sigma公司；咖啡堿（純度≥98%）購自上海源葉生物技術有限公司；去離子水通過Milli-Q凈水系統(tǒng)獲得.

1.1.3 儀器與設備 主要儀器與設備有UPLC-QqQ MS系統(tǒng)（美國Waters公司）、KQ-300GDV型恒溫數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）、Milli-Q AdvantageA 10型純水系統(tǒng)（德國Merck Milipore公司）、7754070型冷凍干燥機（美國LABCONCO公司）、MC京制00000246型精密天平（德國Sartorius公司）、5430R型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）和G560E型渦旋振蕩器（美國Industrial Industries公司）.

圖1 不同茶類加工工序與工藝參數(shù)Fig.1 Processing steps and parameters for different types of tea

1.2 茶樣前處理

茶樣前處理與檢測條件參考文獻[21]的方法，簡要步驟如下：將凍干后的干茶用研砵研磨至均勻粉末，稱取30 mg，加1 mL甲醇，渦旋混勻后于25℃超聲20 min，離心10 min后轉移上清至離心管中，放置在冰箱（-20℃）中保存，用前稀釋到需要濃度，各茶葉樣本重復3次.

1.3 色譜檢測

采用UPLC-QqQ MS系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)采集.

1.3.1 兒茶素組分、蘆丁、咖啡堿和茶氨酸的檢測條件 C18（Waters）色譜柱，柱溫40℃，流動相A為含有0.1%甲酸的水，流動相B為含有0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脫：0～12 min洗脫95%～83%流動相A，12～13 min 洗脫 83%～0%流動相 A，13～16.5 min 洗脫0%～0%流動相 A；流速：0.3 mL·min-1.

1.3.2 氨基酸組分的檢測條件 SeQuant ZIC-HILIC（Merck）色譜柱，柱溫40℃，流動相A為含有5 mmol·L-1乙酸銨的水，流動相B為含有0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脫：0～13 min洗脫5%～41%流動相A，13～15 min洗脫41%～60%流動相 A，15～20 min洗脫60%～5%流動相A；流速：0.4 mL·min-1.

1.4 數(shù)據(jù)處理

UPLC-QqQ MS原始數(shù)據(jù)采用MassLynx 4.1軟件（Waters公司）處理；圖表采用Microsoft Office 2010軟件（微軟公司）制作；繪制熱圖采用MeV 4.9.0軟件（J.Craig Venter Institute公司）進行Log2均一化處理；采用SPSS 19.0軟件（IBM公司）Turkey′s HSD檢驗法進行顯著性分析.

2 結果與分析

2.1 不同茶類兒茶素組分含量的差異

圖2顯示，各茶類樣本中，EGCG均為含量最高的兒茶素組分.在鮮葉、綠茶和烏龍茶中，主要兒茶素組分含量從高到低依次為EGCG、EGC、ECG和EC；而在紅茶和白茶中，ECG含量高于EGC含量，說明在紅茶和白茶的加工過程中，EGC含量的下降幅度大于ECG含量.

圖3顯示，鮮葉加工為不同茶類后，各兒茶素組分含量均有不同程度的下降，綠茶中的各兒茶素組分含量與鮮葉最為接近，紅茶下降最多，白茶和烏龍茶的下降幅度介于綠茶與紅茶之間.白茶中的ECG含量高于烏龍茶，且在黃旦品種中達到顯著水平.白茶中的EGCG含量與烏龍茶之間差別不大，但白茶中非酯型兒茶素組分EGC、EC的含量均顯著低于烏龍茶，這同樣反映了在白茶制作的過程中非酯型兒茶素組分含量的下降幅度大于酯型兒茶素.

2.2 不同茶類氨基酸組分含量的差異

圖4顯示：在綠茶中，茶氨酸含量顯著高于其他茶類，天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和甲硫氨基酸的含量也較高；在烏龍茶中，苯丙氨酸、谷氨酰胺和色氨酸的含量顯著高于綠茶和紅茶，茶氨酸、酪氨酸、精氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸的含量較高；在紅茶中，除了亮氨酸還有一定的積累外，其他氨基酸組分含量均較低；在白茶中，丙氨酸、γ-氨基丁酸、絲氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺、賴氨酸和組氨酸的含量顯著高于鮮葉和其他茶類，苯丙氨酸、色氨酸酪氨酸和精氨酸的含量也較高，而在綠茶中含量較大的茶氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸和甲硫氨酸在白茶中的含量較低.

圖2 不同茶類中的兒茶素組分含量Fig.2 Catechins composition for different types of tea

圖3 不同茶類間的兒茶素組分含量Fig.3 Comparison in catechins contents in different types of tea

圖4 不同茶類間的氨基酸組分含量Fig.4 Amino acids contents in different types of tea

2.3 不同茶類蘆丁和咖啡堿含量的差異

圖5 顯示，福云六號鮮葉中的蘆丁含量約為黃旦鮮葉的10倍.與兒茶素組分類似，蘆丁在綠茶、烏龍茶和紅茶中的含量均顯著低于鮮葉，而在白茶中下降不顯著.福云六號白茶的蘆丁含量約為其他茶類的1.5～2.0倍，黃旦白茶的蘆丁含量約為其他茶類的1.5倍.

圖5 不同茶類間的蘆丁含量Fig.5 Rutin contents in different types of tea

圖6 顯示，在福云六號和黃旦品種中，白茶和鮮葉的咖啡堿含量最高，且二者之間的差異不顯著.綠茶的咖啡堿含量低于白茶，但差異不顯著.烏龍茶的咖啡堿含量介于綠茶與紅茶之間，與綠茶、紅茶之間的差異均不顯著.紅茶的咖啡堿含量最低，且兩個品種的咖啡堿含量均顯著低于白茶.

圖6 不同茶類間的咖啡堿含量Fig.6 Caffeine contents in different types of tea

3 討論

本試驗中，茶樹鮮葉加工成不同茶類后兒茶素組分含量均有不同程度的下降.攤放或萎凋工序是不同茶類加工均需經歷的加工工序，隨著攤放或萎凋的進行，在制葉中的兒茶素組分含量顯著下降.兒茶素含量在攤放或萎凋過程中下降的原因為：一方面與兒茶素組分合成相關基因（如無色花青素還原酶基因和花青素還原酶基因）的表達不斷下降有關[22]；另一方面與單體兒茶素不斷轉化為兒茶素衍生物（如甲基化兒茶素、茶黃素組分和茶雙沒食子兒茶素等物質）有關[23].綠茶在高溫殺青之后，茶葉中的各種酶類失活鈍化，兒茶素組分含量在后續(xù)加工過程中未有明顯降低[24-25]，因此，綠茶中兒茶素組分的保留量最大.烏龍茶萎凋后進入做青工序，做青時，茶葉葉緣區(qū)域由于受到機械力的作用，集中于液泡中的兒茶素組分[26]因液泡膜透性增加而與細胞質基質中的多酚氧化酶等酶類接觸[27]，兒茶素組分因受到一定的酶促氧化而較綠茶更低，烏龍茶的葉緣區(qū)域也因此變紅.紅茶萎凋后進入揉捻和發(fā)酵工序，揉捻使鮮葉的細胞膜和細胞壁充分破碎，兒茶素組分與多酚氧化酶等酶類充分接觸，在發(fā)酵2 h后大量降低，茶黃素組分和茶雙沒食子兒茶素等兒茶素氧化產物顯著增加[28].白茶加工全程僅有萎凋和烘干兩個工序，化合物轉化主要在萎凋階段，雖然與鮮葉相比，白茶中各兒茶素組分均有較大幅度下降，但酯型兒茶素EGCG、ECG等的保留量大于EGC、EC等非酯型兒茶素，這體現(xiàn)了白茶、烏龍茶和紅茶不同兒茶素組分的轉化模式，其中的分子機制有待進一步探究.

本試驗中，白茶除茶氨酸和谷氨酸含量持續(xù)降低外，其他大部分氨基酸組分均不斷積累.研究表明，鮮葉游離氨基酸合成的相關基因在萎凋過程中表達活躍，氨基酸總量不斷增加，但屬于非蛋白質氨基酸的茶氨酸不斷降解而降低，其前體乙胺也顯著下降[29].茶氨酸在加工過程中還可與兒茶素結合形成黃酮堿類物質，目前已發(fā)現(xiàn)了15種以茶氨酸為前體形成的黃酮堿類物質[29].綠茶中氨基酸組分的增加不及白茶，證明了酶促水解比熱解更有利于氨基酸組分的增加[30].氨基酸組分可在發(fā)酵的過程中與酚類物質或糖類物質結合形成醌類、醛類、酸類、醇類物質及色素化合物，也可經酶促反應形成香氣而大幅降低[28].本試驗中，幾乎所有的氨基酸組分在紅茶中的含量均較低，而亮氨酸含量較高，因此，亮氨酸或可作為紅茶發(fā)酵標志物；烏龍茶中的谷氨酰胺、苯丙氨酸和色氨酸有積累的趨勢，與前人的研究結果[31]一致，這可能與做青工序相關.苯丙氨酸是烏龍茶重要香氣組分苯甲醇和苯乙醇的前體[32]，因此，烏龍茶做青過程中氨基酸組分的積累與烏龍茶獨特花果香形成有密切聯(lián)系.

茶葉中的黃酮醇類物質與兒茶素組分存在共同前體：二氫槲皮素、二氫山奈酚和二氫楊梅素.在萎凋的過程中，黃酮醇合成酶基因和黃酮醇-3-氧-葡萄糖轉移酶基因表達均上調[22].綠茶在殺青階段，蘆丁等黃酮糖苷類物質不斷降低，至成品降至最低[33]，在做青和發(fā)酵階段蘆丁等黃酮糖苷類物質也會降低[34]，因此可以觀察到綠茶、烏龍茶和紅茶中的蘆丁含量均顯著低于鮮葉.白茶由于經歷長時間的萎凋，且萎凋全程無高溫和機械力作用，其蘆丁得到積累與保留.

咖啡堿含量在鮮葉和白茶中最高，在紅茶中最低.研究表明，隨著茶葉發(fā)酵程度的增加，咖啡堿含量逐漸降低[23]，而高溫處理對咖啡堿含量的影響不大[30].本試驗中由兩個品種制成的白茶，其咖啡堿含量均顯著高于紅茶，說明白茶的加工工藝可能有利于咖啡堿的積累，但其分子機制仍有待進一步探究.

綜上所述，相同品種茶樹鮮葉在不同的加工工藝條件下，其主要代謝產物發(fā)生了不同程度的積累與轉化.綠茶由于在殺青固定前，經歷了短暫攤放，其兒茶素組分、氨基酸組分和咖啡堿含量與鮮葉相比變化最小，而黃酮苷類物質蘆丁含量在殺青和烘干等熱作用下降低；烏龍茶由于經歷更長時間的萎凋以及后續(xù)做青工序，其兒茶素組分、蘆丁、部分氨基酸組分和咖啡堿含量較綠茶進一步降低，谷氨酰胺、苯丙氨酸和色氨酸等氨基酸組分在烏龍茶中積累較多，與烏龍茶做青工序相關；紅茶經歷長時間的萎凋以及后續(xù)揉捻和發(fā)酵工序，其兒茶素組分、蘆丁和咖啡堿含量下降最多，茶氨酸和其他大部分氨基酸含量在紅茶中均大幅下降，但亮氨酸有較高的積累量；白茶全程萎凋，其兒茶素組分含量持續(xù)下降，且非酯型兒茶素的下降量比酯型兒茶素大，白茶加工全程未經歷高溫，有利于黃酮糖苷類物質、氨基酸組分和咖啡堿的保留與積累，而非蛋白質氨基酸茶氨酸含量因長時間萎凋而下降.