曹龍奎，周志國(guó)，周慕潮，刁靜靜，馮興元，王學(xué)群，李麗娜，張麗萍

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江昊天玉米有限公司，黑龍江綏化 152000；3.大慶中禾糧食股份有限公司，黑龍江大慶 163319）

葉黃素是一種具有2個(gè)羥基末端和氧合類胡蘿卜素骨架C40結(jié)構(gòu)的胡蘿卜素醇[1]，脂溶性類胡蘿卜素的一種，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)視力具有一定的保健作用[2]，還降低心血管疾病的發(fā)生率[3]，對(duì)乳腺癌、前列腺癌等癌細(xì)胞具有一定的抑制作用[4-6]，同時(shí)可以維持細(xì)胞正常功能、提高人體免疫力。葉黃素在人體內(nèi)無(wú)法直接合成，只能依靠外界攝取[7]，玉米淀粉生產(chǎn)副產(chǎn)物的玉米黃粉中含有大量的葉黃素，是一種優(yōu)良的葉黃素生產(chǎn)原料。超聲-微波協(xié)同提取是一種較為先進(jìn)的提取方法，具有提取效率高、工藝簡(jiǎn)單、能耗低等優(yōu)勢(shì)。因此，試驗(yàn)采用超聲-微波協(xié)同技術(shù)提取玉米黃粉中的葉黃素，擬得到玉米葉黃素的高效提取方法，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米黃粉，黑龍江昊天玉米開發(fā)有限公司提供；乙腈、甲醇等，為色譜純；乙酸乙酯、乙醇、丙酮等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL20M型臺(tái)式離心機(jī)，常州良友儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；DZF-6050AB型真空干燥箱，上海坤天實(shí)驗(yàn)室儀器產(chǎn)品；RE-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海貝倫儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；1290 2D-LC型高效液相色譜，Agilent公司產(chǎn)品；BILON-CW-1000型超聲-微波協(xié)同萃取儀，上海比朗儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉米黃粉葉黃素提取技術(shù)路線

精確稱量一定量過(guò)80目篩的玉米黃粉，按照一定的料液比添加體積分?jǐn)?shù)95%乙醇和表面活性劑，放入超聲-微波協(xié)同萃取儀中進(jìn)行提取，得到葉黃素提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后進(jìn)行真空干燥，得玉米葉黃素粗品[8]。

1.3.2 單因素試驗(yàn)方法

（1）表面活性劑種類對(duì)葉黃素提取率的影響。稱取玉米黃粉10 g，按照料液比1∶15（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，提取溫度35℃，提取時(shí)間10 min，微波功率300 W，選擇十六烷基三甲基氯化銨（1631）、Tween-20、Tween-80、十二烷基硫酸鈉（SDS）等4種物質(zhì)作為表面活性劑，每個(gè)水平做3個(gè)平行樣，按照葉黃素提取的工藝路線步驟試驗(yàn)，按照葉黃素提取率技術(shù)方法計(jì)算提取率，確定最佳的表面活性劑。

（2）表面活性劑添加量對(duì)葉黃素提取率的影響。稱取玉米黃粉10 g，按照料液比1∶15（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，提取溫度35℃，提取時(shí)間10 min，微波功率300 W，分別考查表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%，0.5%，0.7%，0.9%，1.1%，每個(gè)水平做3個(gè)平行樣，按照葉黃素提取的工藝路線步驟試驗(yàn)，按照葉黃素提取率技術(shù)方法計(jì)算提取率，確定最佳的表面活性劑添加量。

（3）微波功率對(duì)葉黃素提取效率的影響。稱取玉米黃粉10 g，按照料液比1∶15（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，提取溫度35℃，提取時(shí)間10 min，微波功率分別為100，200，300，400，500 W，每個(gè)水平做3個(gè)平行樣，按照葉黃素提取的工藝路線步驟試驗(yàn)，按照葉黃素提取率技術(shù)方法計(jì)算提取率，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出葉黃素提取率與微波功率之間的關(guān)系曲線圖，分析葉黃素提取率隨著微波功率變化的規(guī)律[9]。

（4）提取溫度對(duì)葉黃素提取率的影響。稱取玉米黃粉10 g，按照料液比1∶15（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，微波功率300 W，提取時(shí)間10 min，提取溫度分別為25，30，35，40，45℃5個(gè)水平，每個(gè)水平做3個(gè)平行樣，按照葉黃素提取的工藝路線步驟試驗(yàn)，按照葉黃素提取率技術(shù)方法計(jì)算提取率，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出葉黃素提取率與提取溫度之間的關(guān)系曲線圖，分析葉黃素提取率隨著提取溫度變化的規(guī)律[10]。

（5）提取時(shí)間對(duì)葉黃素提取率的影響。稱取玉米黃粉10 g，按照料液比1∶15（g∶mL）加入95%乙醇，微波功率300 W，提取溫度35℃，提取時(shí)間分別為5，10，15，20，25 min，每個(gè)水平做3個(gè)平行樣，按照葉黃素提取的工藝路線步驟試驗(yàn)，按照葉黃素提取率技術(shù)方法計(jì)算提取率，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出葉黃素提取率與提取時(shí)間之間的關(guān)系曲線圖，分析葉黃素提取率隨著提取時(shí)間變化的規(guī)律[11]。

（6）液料比對(duì)葉黃素提取率的影響。稱取玉米黃粉10 g，微波功率300 W，提取溫度35℃，提取時(shí)間10 min，料液比分別為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，每個(gè)水平做3個(gè)平行樣，按照葉黃素提取的工藝路線步驟試驗(yàn)，按照葉黃素提取的工藝路線步驟試驗(yàn)，按照葉黃素提取率技術(shù)方法計(jì)算提取率，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出葉黃素提取率與液料比之間的關(guān)系曲線圖，分析葉黃素提取率隨著液料比變化的規(guī)律[12]。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方法

采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取方法，試驗(yàn)因素分別為葉黃素提取率（Y），微波功率（X1），提取溫度（X2），提取時(shí)間（X3），料液比（X4）。

試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.4 提取液中葉黃素類總含量的測(cè)定

（1）葉黃素HPLC色譜分析條件。流動(dòng)相為乙醇∶甲醇∶乙腈=5∶5∶90，色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量1μL，柱溫30℃[13]。

（2）葉黃素提取率的計(jì)算方法。分別將葉黃素粗品用5mL乙酸乙酯進(jìn)行溶解，經(jīng)0.45μm微孔膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定樣品中葉黃素的含量，并計(jì)算葉黃素的提取率，計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件對(duì)葉黃素提取率的影響

2.1.1 表面活性劑對(duì)玉米葉黃素提取率的影響

表面活性劑類型對(duì)葉黃素提取率的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，不同的表面活性劑對(duì)葉黃素提取率的影響差異較大，但均高于對(duì)照組，說(shuō)明表面活性劑的添加有助于玉米黃粉中葉黃素的提取[10]。通過(guò)試驗(yàn)可以看出十二烷基硫酸鈉添加后提取率顯著高于其他組。因此，選擇十二烷基硫酸鈉作為試驗(yàn)的輔助提取劑[14]。

2.1.2 表面活性劑添加量對(duì)玉米葉黃素提取率的影響

圖1 表面活性劑類型對(duì)葉黃素提取率的影響

表面活性劑添加量對(duì)葉黃素提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 表面活性劑添加量對(duì)葉黃素提取率的影響

由圖2可知，隨著SDS添加量的不斷提高，葉黃素的提取率呈不斷上升的趨勢(shì)，在0.9%左右提取率接近最大值，之后趨于平衡。因此，選擇最佳的SDS添加量為0.9%。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)玉米葉黃素提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)葉黃素提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)葉黃素提取率的影響

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的增加，提取率呈先增大后減小的趨勢(shì)，在15 min達(dá)到最大值。隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，葉黃素結(jié)構(gòu)也受到破壞，導(dǎo)致提取率不斷下降。綜合考慮，選擇提取時(shí)間15 min為中心進(jìn)一步的試驗(yàn)優(yōu)化[14]。

2.1.4 提取溫度對(duì)玉米葉黃素提取率的影響

提取溫度對(duì)葉黃素提取率的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，隨著提取溫度的不斷增加，葉黃素提取率逐漸增大，當(dāng)提取溫度達(dá)到35℃時(shí)達(dá)到最大值。隨著提取溫度大于35℃后，對(duì)葉黃素的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，葉黃素的提取率逐漸降低。因此為進(jìn)一步明確提取溫度對(duì)葉黃素提取的影響，選取提取溫度35℃為中心進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)優(yōu)化。

圖4 提取溫度對(duì)葉黃素提取率的影響

2.1.5 微波功率對(duì)玉米葉黃素提取率的影響

微波功率對(duì)葉黃素提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 微波功率對(duì)葉黃素提取率的影響

由圖5可知，隨著微波功率的不斷增大，葉黃素提取率逐漸增大，當(dāng)微波功率為300 W時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)微波功率大于300 W后溫度會(huì)隨之提高，對(duì)葉黃素的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。因此為進(jìn)一步明確微波功率對(duì)葉黃素提取的影響，選取300 W為中心進(jìn)行微波提取的試驗(yàn)優(yōu)化。

2.1.6 料液比對(duì)玉米葉黃素提取率的影響

料液比對(duì)葉黃素提取率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 料液比對(duì)葉黃素提取率的影響

由圖6可知，隨料液比的增大，提取率先增大達(dá)到一定程度呈現(xiàn)平衡的趨勢(shì)。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)料液比在1∶15（g∶mL）后提取率趨于平衡，因此，為進(jìn)一步明確料液比對(duì)葉黃素提取的影響，選取1∶15（g∶mL）為中心進(jìn)行微波提取的試驗(yàn)優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果與分析

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以微波功率、提取溫度、提取時(shí)間、料液比為自變量X，以葉黃素提取率為固變量（Y），進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)[12]。

試驗(yàn)安排及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)安排及試驗(yàn)結(jié)果

回歸方程的方差分析見(jiàn)表3，二次回歸模型參數(shù)見(jiàn)表4。

表3 回歸方程的方差分析

由表3可知，回歸模型p＜0.01，而失擬項(xiàng)的p＞0.05，說(shuō)明該模型擬和結(jié)果較好。一次項(xiàng)、二次項(xiàng)p＜0.01，交互項(xiàng)p＜0.05，說(shuō)明各項(xiàng)均不同程度影響葉黃素的提取率。

以葉黃素提取率為Y值，得出微波功率、提取溫度、提取時(shí)間、料液比為X值的回歸方程為：

表4 二次回歸模型參數(shù)

2.3 最優(yōu)條件確定

最優(yōu)提取條件及吸光度見(jiàn)表5。

表5 最優(yōu)提取條件及吸光度

提取效果最高時(shí)的微波功率345 W，提取溫度38℃，提取時(shí)間16 min，料液比1∶14.8（g∶mL），該條件下理論最大的得率為9.33%。驗(yàn)證試驗(yàn)得到葉黃素得率為9.30%±0.11%，與理論值非常接近，可以看出試驗(yàn)建立的模型能夠較好地反映出超聲微波協(xié)同提取葉黃素的條件。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)表面活性劑種類及添加量的單因素分析，確定最佳的表面活性劑為十二烷基硫酸鈉，添加量為0.9%。確定了超聲微波協(xié)同提取玉米葉黃素的最佳工藝參數(shù)為微波功率345 W，提取溫度38℃，提取時(shí)間16 min，料液比1∶14.8（g∶mL），該條件下得到葉黃素得率為9.30%±0.11%，研究得到了玉米葉黃素的高效提取方法，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。