宋 丹，李 鵬，劉翠翠，陳金頂，易 琳，丁紅星，趙明秋

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642)

豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)，是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的三大呼吸道疾病之一，是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的以壞死性和纖維性出血性肺炎為特征的傳染性疾病[1-3]。該病自1957 年發(fā)現(xiàn)并報道以來，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給集約化養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。目前，我國主要通過接種滅活疫苗來預(yù)防PCP，但由于該病原血清型較多、毒力因子復(fù)雜等，常規(guī)疫苗的使用已經(jīng)無法達(dá)到有效預(yù)防該疾病的目的。因此，開發(fā)新型、安全高效的疫苗已經(jīng)成為該領(lǐng)域研究的熱點。

APP 能夠產(chǎn)生多種致病因子，包括脂多糖、莢膜多糖、外膜蛋白(OMP)、溶血外毒素和轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白等，其致病機(jī)理較為復(fù)雜，各組分間的相互作用尚未徹底明確[6-7]。溶血外毒素(Apx)被認(rèn)為是APP 引起宿主肺部感染最主要的毒力因子[8]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Apx 有ApxⅠ、ApxⅡ、Apx Ⅲ和Apx Ⅳ，其中ApxⅠ具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性和溶血活性，是APP 重要的毒力基因和保護(hù)性抗原；ApxⅡ具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，Jansen 等證實該毒素生物活性的發(fā)揮需要完整的毒力基因；Apx Ⅲ無溶血活性但有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性；Apx Ⅳ毒素是最晚發(fā)現(xiàn)的，但其存在于APP 的所有血清型中[9-10]。本研究室前期研究結(jié)果顯示rApxⅠA、rApxⅡA 和重組OMP (rOMP)聯(lián)合免疫小鼠比單因子免疫能夠產(chǎn)生更高的抗體水平和更強(qiáng)的保護(hù)力[11]，本研究在此基礎(chǔ)上利用基因工程的方法表達(dá)兩種重組蛋白rApx ⅢA 和rApx ⅣA，并將表達(dá)純化后的4 種Apx 重組蛋白和外膜重組蛋白按質(zhì)量等比混合制成疫苗，以期獲得一種安全高效的PCP 亞單位疫苗，為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體與實驗動物 大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、表達(dá)載體pET-32a(+)、血清Ⅰ型APP(LD50為4.56×106cfu)、APP 陽性血清、重組蛋白rApxⅠA、rApxⅡA 和rOMP 均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室保存[11]；PCP 滅活疫苗為武漢科前動物生物制品有限公司產(chǎn)品。4 周齡～6 周齡BALB/c 雌性小鼠購自廣州南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物科技有限公司。

1.2 主要試劑 高保真酶Primestar、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA 連接酶和IPTG等購自TaKaRa 公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購自Sigma 公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)mega 公司；His FF 蛋白純化柱購自GE 公司；蛋白濃度測定試劑盒購自上海Thermo 公司；羊抗鼠IgG-HRP、丙烯酰胺和考馬斯亮藍(lán)等購自廣州豪凱生物科技有限公司；甘氨酸、NAD、Tris base 和KCl 等無機(jī)化學(xué)試劑購自廣州康龍公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 參照GenBank 中登錄的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ApxⅢA基因序列(AF363363.1)和ApxⅣA基因序列(AX002405)分別設(shè)計合成了一對特異性引物。在擴(kuò)增ApxⅢA基因的上下游引物P1/P2 中分別引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，在擴(kuò)增ApxⅣA基因的上下游引物P3/P4中分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。引物序列為P1：5'-CGCGGATCCTTGGTTACTGGTATCACAGG-3'/P2：5'-CCGCTCGAGTTAACTCAATTCGCGCGTAACA-3'；P3： 5'-CCGGAATTCGGCAAAGGGAATGATGTG-3'/P4： 5'-CCGCTCGAGTTACCCATTATTTCCGTCCGG T-3' (下劃線處為酶切位點)。

1.4 重組表達(dá)載體pET-ApxⅢA和pET-ApxⅣA的構(gòu)建與鑒定 按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書從PCP 滅活疫苗中提取APP 的DNA，以其為模板，分別用特異性引物P1/P2 和P3/P4 PCR 擴(kuò)增ApxⅢA基因和ApxⅣA基因(94 ℃5 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃40 s，共30 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min)。對PCR 產(chǎn)物回收純化后通過雙酶切將ApxⅢA基因和ApxⅣA基因分別克隆于表達(dá)載體pET-32a(+)中，經(jīng)雙酶切、測序驗證后將重組質(zhì)粒命名為pETApxⅢA、pET-ApxⅣA。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定 分別將重組質(zhì)粒pET-ApxⅢA、pET-ApxⅣA轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.6左右，經(jīng)IPTG (終濃度為1.0 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)后取1 mL 菌液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，檢測重組蛋白的表達(dá)。取適量上述誘導(dǎo)后的菌體沉淀按照1 mL His FF 柱說明書純化，純化后的rApx ⅢA 和rApx ⅣA同本研究室前期表達(dá)純化過的rApxⅠA、rApxⅡA和rOMP 一起采用BCA 法測定蛋白濃度后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳分析后，以APP 陽性血清(1∶100)為一抗，再以羊抗鼠IgG-HRP(1∶5 000)為二抗，通過DAB 底物顯色進(jìn)行western blot 分析重組蛋白的反應(yīng)原性。

1.6 疫苗的制備 根據(jù)上述1.5 中測定的蛋白濃度，將表達(dá)純化后的rApxⅠA、rApxⅡA、rApx ⅢA、rApx ⅣA 和rOMP 按質(zhì)量等比例混合，并將其與弗氏佐劑按1∶1 的體積比或與白油佐劑按1∶2 的體積比乳化，制備成抗原終濃度均為500 μg/mL (各蛋白各100 μg/mL)的重組亞單位疫苗，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 小鼠免疫及抗體效價的測定 為評估本研究制備的重組亞單位疫苗的免疫效果，將50 只BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為5 組(Ⅰ～Ⅴ組)，每組10 只。第Ⅰ組接種PCP 滅活疫苗；第Ⅱ組接種弗氏佐劑乳化的亞單位疫苗；第Ⅲ組接種白油佐劑乳化的亞單位疫苗；第Ⅳ組接種PCP 滅活疫苗+ 白油佐劑乳化的亞單位疫苗；第Ⅴ組接種PBS，免疫劑量均為200 μL/只(表1)。每次免疫間隔兩周，均采用皮下接種途徑，共免疫3 次。各組小鼠分別在一免后7 d、21 d和35 d 斷尾采血，分離血清。采用方陣滴定法測定各抗原最佳包被濃度、血清稀釋度、羊抗鼠IgG-HRP 稀釋度和抗體孵育條件，根據(jù)最佳反應(yīng)條件分別包被各抗原后采用間接ELISA[12-13]測定小鼠血清中的rApxⅠA、rApxⅡA、rApx ⅢA、rApx ⅣA 和rOMP 的抗體水平。

表1 動物試驗設(shè)計Table 1 Design of the animal experiments

1.8 攻毒保護(hù)試驗 按照表1 中的動物分組與免疫程序接種小鼠進(jìn)行免疫效果測定，每次免疫間隔兩周。三免一周后，用對數(shù)生長期的血清Ⅰ型APP 菌液對各組小鼠經(jīng)腹腔注射攻毒，攻毒劑量為10 LD50/只(4.56×107cfu)，攻毒后1 h～72 h 觀察并記錄小鼠發(fā)病和死亡情況，計算各組死亡率和保護(hù)率。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達(dá)載體pET-ApxⅢA和pET-ApxⅣA的構(gòu)建與鑒定 以APP 的基因組DNA 為模板，用特異性引物P1/P2，PCR 擴(kuò)增出一條約850 bp(ApxⅢA基因)的目的條帶；用特異性引物P3/P4，擴(kuò)增出一條約700 bp (ApxⅣA基因)的目的條帶，均與預(yù)期一致(圖1)。分別將目的基因ApxⅢA、ApxⅣA克隆于pET-32a(+)載體，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pETApxⅢA和pET-ApxⅣA。

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-ApxⅢA經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后顯示在約5 800 bp 和850 bp 各有一條特異性條帶；重組質(zhì)粒pET-ApxⅣA經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后顯示在約5 800 bp 和700 bp 各有一條特異性條帶，均與預(yù)期一致(圖2)。表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-ApxⅢA和pET-ApxⅣA。

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定結(jié)果 將鑒定正確的pET-ApxⅢA、pET-ApxⅣA分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，陽性重組菌經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE 檢測結(jié)果顯示，經(jīng)誘導(dǎo)的pET-32a-ApxⅢA/BL21 在50 ku 有一條目的條帶；經(jīng)誘導(dǎo)的pET- 32a-ApxⅣA/BL21 在45 ku 有一條目的條帶，均與預(yù)期一致(圖3)，表明重組蛋白(rApx ⅢA、rApx ⅣA)獲得了表達(dá)。純化后的rApx ⅢA、rApx ⅣA 同本研究室前期純化的rApxⅠA、rApxⅡA 和rOMP 經(jīng)BCA 法測定的蛋白濃度分別為459 μg/mL、1 393 μg/mL、1 229 μg/mL、856 μg/mL、699 μg/mL。western blot鑒定結(jié)果顯示，在50 ku 出現(xiàn)rApx ⅢA 特異性條帶(圖4A)；在45 ku 出現(xiàn)rApx ⅣA 特異性條帶(圖4B)，表明兩種重組蛋白均具有良好的反應(yīng)原性。

圖1 Apx ⅢA 基因和Apx ⅣA 基因的PCR 擴(kuò)增Fig.1 The amplification of Apx ⅢA and Apx ⅣA genes by PCR

圖2 重組質(zhì)粒pET-Apx IIIA、pET-Apx IVA 的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of pET-Apx IIIA and pET-Apx IVA positive plasmid construts by enzyme digestions

2.3 免疫后小鼠血清特異性抗體的檢測結(jié)果 根據(jù)方陣滴定法優(yōu)化的各反應(yīng)條件，采用間接ELISA 檢測小鼠血清各特異性抗體水平。rApxⅠA、rApxⅡA、rApx ⅢA、rApx ⅣA 和rOMP 的最佳包被濃度分別為2.87 μg/mL、2.18 μg/mL、7.68 μg/mL、1.34 μg/mL和1.09 μg/mL，待檢血清的最佳稀釋度為1 ∶300，羊抗鼠IgG-HRP 的最佳稀釋度為1∶5 000，抗體最佳反應(yīng)條件為37 ℃孵育1 h。結(jié)果顯示，除Ⅴ組，其它各組小鼠血清中rApxⅠA 抗體呈逐漸上升趨勢；Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組小鼠血清中所有抗體水平均較高，顯著高于Ⅴ組(p＜0.05)；首免后，Ⅳ組小鼠的rOMP 抗體顯著高于其它各組(p＜0.05)，加強(qiáng)免疫后，其它各免疫組小鼠的rOMP 抗體水平也較高；Ⅱ組和Ⅲ組的所有抗體水平變化趨勢基本一致，無顯著差異(p＞0.05)(圖5)。表明本研究中的亞單位疫苗均能夠有效刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生一定的免疫應(yīng)答反應(yīng)，白油佐劑與弗氏佐劑對亞單位疫苗呈現(xiàn)的免疫增強(qiáng)效果無明顯差異。

圖3 重組蛋白rApx IIIA、rApx IVA 的SDS-PAGE 檢測Fig.3 Detection of rApx IIIA and rApx IVA protein by SDS-PAGE

圖4 rApx ⅢA、rApx ⅣA 的western blot 鑒定Fig.4 Identification of rApx ⅢA, rApx ⅣA by western blot

2.4 攻毒保護(hù)試驗 三免7 d 后，用對數(shù)生長期的血清Ⅰ型APP 菌液對各組小鼠經(jīng)腹腔注射攻毒。結(jié)果顯示，攻毒20 h 后各組小鼠均出現(xiàn)不同程度的死亡，攻毒72 h 后Ⅰ組小鼠存活率為50 % (5/10)，Ⅱ組和Ⅲ組小鼠存活率均為40 % (4/10)，Ⅳ組小鼠存活率為20 % (2/10)；Ⅴ組小鼠攻毒24 h 后全部死亡(圖6)。表明本研究的亞單位疫苗對小鼠具有一定的免疫保護(hù)效力，但保護(hù)力低于PCP 滅活疫苗，推測滅活疫苗中可能含有能夠刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的其它菌體成分；而PCP 滅活疫苗+ 白油佐劑乳化的亞單位疫苗免疫保護(hù)效果不理想，推測可能是受到免疫劑量的影響：該組中滅活疫苗的劑量低于Ⅰ組，菌體成分不能有效刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，保護(hù)率也低于Ⅰ組；接種亞單位疫苗的劑量低于Ⅲ組，毒素蛋白能夠刺激小鼠機(jī)體在短期內(nèi)產(chǎn)生較高的抗體水平但不能使小鼠獲得長期保護(hù)，最終保護(hù)率也低于Ⅲ組。

圖5 小鼠血清各特異性抗體檢測結(jié)果Fig.5 Determination of the serum antibody titers in immunized mice

圖6 小鼠攻毒后的存活率結(jié)果Fig.6 Survival rates of BABL/c mice after challenge

3 討 論

PCP 是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的呼吸道疾病，其病原APP 血清型較多且各血清型之間缺乏良好的交叉保護(hù)，給該疾病的防治帶來難題，嚴(yán)重制約了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[14-15]。疫苗接種是預(yù)防該疾病最有效的措施，當(dāng)前市售的主要是PCP 滅活疫苗，但滅活過程中有些抗原成分可能被破壞或丟失并不能達(dá)到理想的免疫保護(hù)效果。因此，高效多價、成本低廉、安全性強(qiáng)，應(yīng)用簡單的基因工程疫苗展現(xiàn)出良好的發(fā)展前景[16]。本研究室曾評估過rApxⅠA、rApxⅡA和rOMP 的保護(hù)力，研究表明3 種重組蛋白聯(lián)合免疫效果優(yōu)于單因子免疫，本研究在3 種蛋白聯(lián)合的基礎(chǔ)上加入rApx ⅢA 和rApx ⅣA，以期獲得一種安全性更高，免疫效果更好的PCP 新型疫苗。

Apx 是APP 的一個非常重要的毒力因子，在APP 的感染過程和刺激機(jī)體防御系統(tǒng)功能方面均發(fā)揮著重要作用。參考何玉龍等[17]對Apx基因的分析，本研究選取Apx ⅢA、Apx ⅣA 中具有優(yōu)勢抗原表位的片段，并選用具有較多克隆位點的pET-32a(+)原核表達(dá)載體，其帶有的His 標(biāo)簽為蛋白純化提供了便利。佐劑也是影響疫苗免疫效果的一個重要因素[18-19]，鑒于弗氏佐劑成本過高不適合在生產(chǎn)中應(yīng)用，本研究設(shè)立白油佐劑乳化的亞單位疫苗組，結(jié)果表明兩種佐劑乳化的亞單位疫苗免疫小鼠后其抗體水平基本一致，攻毒保護(hù)率也相同，實際生產(chǎn)中可以用白油佐劑代替弗氏佐劑以節(jié)約成本。王春來等經(jīng)原核表達(dá)獲得了rApxⅡA，證明其與滅活疫苗聯(lián)合免疫可以增強(qiáng)滅活疫苗的保護(hù)效果[20]，本研究設(shè)立的PCP 滅活疫苗與亞單位疫苗聯(lián)合免疫組小鼠抗體水平較滅活疫苗組有一定提升，但保護(hù)率低于滅活疫苗組，推測可能是受到免疫劑量、成分配比等因素的影響。

天然菌體成分的提取不僅成本高，而且過程繁瑣，以基因工程方法獲得的重組亞單位疫苗安全性好，穩(wěn)定性高，為大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。本研究中滅活疫苗的保護(hù)率沒有達(dá)到100 %，這與王春來等的研究結(jié)果一致[20]，表明傳統(tǒng)的滅活疫苗不能使動物獲得完全保護(hù)，新型疫苗的研制刻不容緩。Wang 等將rApxⅠA、rApxⅡA、rApx ⅢA、rApx ⅣN和rOMP 聯(lián)合免疫動物獲得較高的抗體水平，證實rApx ⅣN 在增強(qiáng)機(jī)體免疫中發(fā)揮重要作用[21]。本研究在前期Apx 蛋白研究基礎(chǔ)上加入rApx ⅢA 和rApx ⅣA，期望該種組合能夠獲得更好的免疫保護(hù)效果，但最終的保護(hù)率還是低于滅活疫苗，推測可能是由于rApx ⅣA 與rApx ⅣN 的作用截然相反，rApx ⅣA 的存在可能抑制了其它抗體的產(chǎn)生，降低了亞單位疫苗整體的免疫效果。Apx Ⅳ毒素是最晚發(fā)現(xiàn)的，其致病機(jī)理與免疫機(jī)制尚不完善，關(guān)于Apx Ⅳ毒素的各項研究還需要進(jìn)一步開展，以便為利用其優(yōu)勢研制高效的PCP 基因工程亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。