時(shí)建立，彭 喆，吳曉燕，，王 碩，孫盼盼，王 妍，李 俊

（1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100；2. 山東師范大學(xué)生命科學(xué)院，山東濟(jì)南 250014；3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109）

豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征（PMWS）等多種疾病[1]，是當(dāng)前嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。豬圓環(huán)病毒毒株一直在不斷地變異，其中由PCV2 引發(fā)的疾病引起了研究人員更為廣泛的關(guān)注，但到目前為止，其致病機(jī)制尚未被完全闡明。

信號(hào)通路在病毒感染細(xì)胞后的復(fù)制和致病力等方面發(fā)揮著重要作用。PCV2 感染后引發(fā)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究將有助于闡明PCV2 的致病機(jī)理。

TLR/MyD88/NF-κB、JNK/p38MAPK、PI3K/Akt

以及AMPK/ERK/TSC2/mTOR 等信號(hào)通路，在PCV2 感染過(guò)程中發(fā)揮著促進(jìn)感染細(xì)胞凋亡、促進(jìn)或增強(qiáng)病毒本身復(fù)制能力等作用[2-9]，基因描述見(jiàn)表1。JAK-STAT 途徑是多數(shù)細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在α-IFN 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要作用。α-IFN 與細(xì)胞膜上α-IFN 受體結(jié)合，激活JAKSTAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，控制包括免疫應(yīng)答、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化和血細(xì)胞生成等多種重要的生物學(xué)功能。截至目前，JAK-STAT 信號(hào)通路在PCV2 感染PK-15 細(xì)胞時(shí)的作用機(jī)制及其與病毒復(fù)制的相關(guān)性尚無(wú)報(bào)道。

本研究采用PCR 列陣方法，建立PK-15 細(xì)胞JAK-STAT 信號(hào)通路的功能分類(lèi)芯片，通過(guò)分析JAK-STAT 信號(hào)通路中Jak 和Stat 家族成員、激活JAK-STAT 信號(hào)通路的受體、與Stat 蛋白相關(guān)的核輔助因子及共同活化因子、Stat 誘導(dǎo)蛋白及該通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)蛋白等基因在PCV2 感染前后的差異表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究JAK-STAT 信號(hào)通路在PCV2 感染時(shí)起作用的關(guān)鍵基因、影響PCV2 復(fù)制的分子機(jī)制、提高病毒滴度及宿主抗病毒免疫反應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料與儀器

PK-15 細(xì)胞PCR-Array 分類(lèi)芯片、RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒：購(gòu)自QIAGEN 公司；Roche480 II 熒光定量PCR 儀：購(gòu)自德國(guó)羅氏公司。其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純品。

1.2 病毒感染和RNA 提取

無(wú)PCV1 污染的PK-15 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（GIBCO）中，6 孔板長(zhǎng)到80%時(shí)接種滴度為106.0TCID50/mL PCV2 SD 株（GenBank：DQ478947）1 mL，分別培養(yǎng)24、48、60 和72 h，棄上清液；采用QIAGEN 公司的RNA 提取試劑盒提取RNA，具體步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 反轉(zhuǎn)錄和PCR-Array 反應(yīng)

采 用QIAGEN 公 司 的RT2 First Strand 試 劑盒進(jìn)行cDNA 合成，操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR-Array 反應(yīng)在96 孔板中進(jìn)行，取反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 102 μL，QIAGEN 公司2×RT2SYBR Green Mastermix 1 350 μL，再加入無(wú)RNase 的水至2 700 μL；將其加入96 孔板中，25 μL/孔，按照以下程序進(jìn)行熒光定量反應(yīng)：95 ℃ 10 min、95 ℃15 s、60 ℃ 1 min，并收集熒光信號(hào)，72 ℃ 15 s，40 個(gè)循環(huán)。采用QIAGEN 公司的線上數(shù)椐庫(kù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 相對(duì)定量PCR 驗(yàn)證

根據(jù)PCR-Array 統(tǒng)計(jì)結(jié)果，選擇接種病毒后上調(diào)、下調(diào)明顯的基因，應(yīng)用熒光定量PCR 重新驗(yàn)證，以GAPDH 為內(nèi)參基因，進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)。選擇基因及其引物設(shè)計(jì)如下：

應(yīng)用以下程序進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，擴(kuò)增曲線：95 ℃ 30 s，循環(huán)1 次；95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s，循環(huán)40 次，72 ℃單點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)。溶解曲線：95 ℃ 0 s、65 ℃ 15 s、95 ℃ 0 s，連續(xù)檢測(cè)信號(hào)。

表1 相對(duì)定量PCR 試驗(yàn)中的基因名稱(chēng)及引物序列

采用2-△△Ct 法，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-Array 反應(yīng)

通過(guò)QIAGEN 公司的線上數(shù)椐庫(kù)，對(duì)PCRArray 的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：除去應(yīng)用的6 個(gè)對(duì)照基因后，選擇的90 個(gè)JAK-STAT信號(hào)通路相關(guān)基因，在PCV2 接種PK-15 細(xì)胞24 h 后，提取樣品中有39 個(gè)基因?yàn)橄抡{(diào)基因，16 個(gè)為上調(diào)基因；48 h 后，提取樣品中有36 個(gè)基因?yàn)橄抡{(diào)基因，21 個(gè)為上調(diào)基因；60 h 后，提取樣品中有51 個(gè)基因?yàn)橄抡{(diào)基因，9 個(gè)為上調(diào)基因；72 h 后，提取樣品有53 個(gè)基因?yàn)橄抡{(diào)基因，13 個(gè)為上調(diào)基因。此結(jié)果也進(jìn)一步證明，細(xì)胞中JAK-STAT 信號(hào)通路對(duì)病毒感染后的調(diào)控是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，不同時(shí)間點(diǎn)有不同的基因參與調(diào)控，而且不同時(shí)間點(diǎn)的部分基因表達(dá)有顯著性差異，從而盡可能維持細(xì)胞平衡?；虿町惐磉_(dá)情況如圖1 所示。

圖1 JAK-STAT 信號(hào)通路在不同時(shí)間點(diǎn)提取樣品后的差異基因表達(dá)情況

2.2 相對(duì)定量PCR 檢測(cè)

根據(jù)PCR-Array 檢測(cè)結(jié)果，重新選取在4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)都有明顯差異表達(dá)的16 個(gè)基因合成引物，以GAPDH 為內(nèi)參基因進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)。結(jié)果顯示：在選擇的16 個(gè)基因中，和PK-15 細(xì)胞對(duì)照組相比，基因IL2RG、PIAS3、ISG15、SOCS3 和IL10RA 基因上調(diào)表達(dá)明顯，與PK-15 細(xì)胞對(duì)照組差 異 顯 著；B2M、IRF1、GRB2、LRG1 和GRB2基因的上調(diào)表達(dá)，與PK-15 細(xì)胞對(duì)照組相比差異 不 顯 著；SMAD4、CEBPB、JAK2、STAT5A、INSR、JUN 和SRC 基因的下調(diào)表達(dá)，與PK-15 細(xì)胞對(duì)照組相比差異不顯著，和PCR-Array 檢測(cè)結(jié)果基本一致（圖2）。

3 討論

PCV2 1991 年在加拿大首次暴發(fā)，隨后在世界許多國(guó)家和地區(qū)流行。目前我國(guó)大部分豬群中存在PCV2 感染，且常與多種病原混合感染，造成形式多樣、病理復(fù)雜的臨床癥狀，尤其是斷乳仔豬，同時(shí)表現(xiàn)腹瀉、呼吸困難、嚴(yán)重消瘦、貧血，偶爾伴有黃疸，隨著共感染病原的不同，死亡率也有很大差異，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[10]。

圖2 熒光定量PCR 檢測(cè)基因差異表達(dá)情況

細(xì)胞因子IL-2 不僅在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，而且能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。Teng 等[11]發(fā)現(xiàn)，PK-15 細(xì)胞轉(zhuǎn)染IL-2 基因并穩(wěn)定表達(dá)后，能夠顯著提高PCV2 的增值能力，在PCV2 增值中發(fā)揮著重要作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，在PK-15 細(xì)胞接種PCV2 后，IL-2 受體基因（IL2RG）表達(dá)明顯上調(diào)，IL-2 受體與IL-2 特異性結(jié)合后，可活化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。主要發(fā)揮作用的3 條信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為：JAK/STAT5 通路、P13K/Akt/mTOR 通路以及絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通路。不同類(lèi)型的細(xì)胞可以通過(guò)激活不同的分子進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，3 條通路既相互聯(lián)系，又相互影響。本研究還發(fā)現(xiàn)，活化 Stat 的蛋白抑制物3（PIAS3）、干擾素刺激基因15（ISG15）等在PCV2 感染后也有明顯的上調(diào)表達(dá)，提示其在病毒刺激機(jī)體產(chǎn)出先天性免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。對(duì)于IL-2 及其受體基因在PCV2 感染PK-15細(xì)胞中的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3（SOCS3）作為SOCS 家族的重要成員之一，是在細(xì)胞因子和生長(zhǎng)相關(guān)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起負(fù)性調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)因子。大量研究證明，SOCS3 基因可被多種炎癥因子誘導(dǎo)表達(dá)，并且可抑制多種免疫分子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖3）。最近的報(bào)道顯示，SOCS3 基因的過(guò)表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡，并且降低AKT 磷酸化水平，說(shuō)明SOCS3 基因能夠抑制AKT 激活，從而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)。Zhu 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PCV2 感染后，SOCS3 基因在沒(méi)有臨床癥狀仔豬的PBM 細(xì)胞中出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，在PK-15 細(xì)胞中也是上調(diào)表達(dá)，被小干擾RNA 抑制后，IL-6 和TNF-α 的表達(dá)量明顯上調(diào)，因此SOCS3 基因可抑制原代免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，在PCV 2 亞臨床感染中發(fā)揮重要作用。本研究也證實(shí)，PCV2 感染后SOCS3 基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，但對(duì)JAK/STAT 信號(hào)通路及其在PCV2 感染PK-15 細(xì)胞中的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

圖3 Jak-stat 信號(hào)通路發(fā)揮作用示意圖

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)：PCV2 感染PK-15 細(xì)胞后，JAK-STAT 信號(hào)通路所有已知的Jak 和Stat 家族成員、激活JAK-STAT 信號(hào)通路的受體、與Stat 蛋白相關(guān)的核輔助因子及共同活化因子、Stat 誘導(dǎo)蛋白及該通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)蛋白等基因均發(fā)生差異表達(dá)；信號(hào)通路對(duì)病毒感染后的調(diào)控是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，不同時(shí)間點(diǎn)有不同的基因參與調(diào)控，從而盡可能維持細(xì)胞平衡。