高志強(qiáng)，汪 琳，趙相鵬，蒲 靜，尹 羿，尹立勇，張 偉，任 彤

（1.北京海關(guān)技術(shù)中心，北京 100026；2.順義區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，北京 101300）

豬圓環(huán)病毒2 型（porcine circovirus type 2，PCV2）是一種重要的豬病病原，于1997 年在加拿大被首次發(fā)現(xiàn)，隨后在大多數(shù)養(yǎng)豬國(guó)家被發(fā)現(xiàn)。PCV2 可引起豬的多種病癥，包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）、繁殖障礙、肉芽腫性腸炎、壞死性淋巴結(jié)炎等。PCV2 感染還可造成豬群免疫力下降，導(dǎo)致多種疫苗免疫失敗，豬只死亡率升高，因此對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害巨大[1]。PCV2 為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，無(wú)囊膜，基因組為單鏈環(huán)狀DNA，大小為1 767～1 768 nt，包含2 個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），分別為ORF1 和ORF2。其中ORF1 編碼復(fù)制相關(guān)蛋白（Rep 和Rep'），ORF2編碼病毒衣殼蛋白（Cap）。ORF2 為病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因，也是核酸擴(kuò)增檢測(cè)的主要靶區(qū)域[2]。

PCV2 變異的研究表明，由于遺傳變異導(dǎo)致目前國(guó)內(nèi)PCV2 存在多種不同基因型。一些研究表明，PCV2 基因序列差異與分離地域相關(guān)，與致病性相關(guān)性不大。21 世紀(jì)以來(lái)，世界范圍內(nèi)PCV2 的優(yōu)勢(shì)基因型持續(xù)發(fā)生變異，其中基因型 PCV2b 流行最廣泛且其致病性增強(qiáng)。一些報(bào)道也表明，Cap 基因一個(gè)單核苷酸的缺失突變可引起Cap 蛋白的延長(zhǎng)。目前國(guó)際上根據(jù)ORF2 序列的遺傳距離，即達(dá)到0.035 時(shí)，判定為不同基因型，從而將PCV2 分為3個(gè)基因型，分別為PCV2a、PCV2b 和PCV2c。其中，PCV2a、PCV2b 在豬群中廣泛流行，而PCV2c僅在20 世紀(jì)80 年代在丹麥有報(bào)道，目前沒(méi)有流行。近年來(lái)國(guó)內(nèi)又報(bào)道了新的基因型PCV2d[3-4]。

本研究通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外流行的3 個(gè)基因型（PCV2a、PCV2b 和PCV2d）毒株序列進(jìn)行比對(duì)研究，建立了靈敏特異的PCV2 通用型熒光PCR 檢測(cè)方法。用此方法從北京順義區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所查獲送檢的2 批次病死豬的多臟器中檢出PCV2，為進(jìn)一步了解檢出PCV2 病毒的基因特征，對(duì)3 份不同批次樣品中分離的病毒進(jìn)行了全基因組擴(kuò)增檢測(cè)分析，經(jīng)進(jìn)化分析確認(rèn)為PCV2b 和PCV2d 基因型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒核酸及被檢樣品 豬瘟病毒HCLV cDNA、 偽 狂 犬 病 毒Nanyangju 核 酸、豬繁殖與呼吸綜合征病毒MLV RespPRRS/Repro cDNA、 豬 傳 染 性 胃 腸 炎 病 毒Purdue115 cDNA、PCV2 QD 株DNA，均為本實(shí)驗(yàn)室保存；人工合成含有PCV2 完整ORF2 基因（AY391729），克隆于質(zhì)粒pBluescript II SK（+）；被檢樣品，來(lái)自2017 年4 月—12 月采集的45 份病死豬臟器，由北京市順義區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所送檢。

1.1.2 主要試劑 血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒（DP304），購(gòu)自天根生化科技有限公司；Ex HS Taq DNA 聚合酶、dNTP 等，購(gòu)自TaKaRa 公司；核酸純化柱及套管，購(gòu)自上海生工。

1.1.3 主要設(shè)備 LightCycler 480，購(gòu)自Roche 公司；AB 9700，購(gòu)自AB 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針合成 隨機(jī)選取國(guó)內(nèi)存在的3個(gè)基因型（PCV2a、PCV2b 和PCV2d）毒株序列，在序列比對(duì)基礎(chǔ)上，針對(duì)ORF2 設(shè)計(jì)合成1 套熒光PCR 引物探針，用于樣品檢測(cè)。探針序列比較結(jié)果見(jiàn)圖1。同時(shí)依據(jù)文獻(xiàn)合成一對(duì)反向交叉引物，用于擴(kuò)增PCV2 全基因組[4]。引物探針名稱、序列及靶基因見(jiàn)表1。

圖1 引物探針設(shè)計(jì)區(qū)域的序列比對(duì)結(jié)果

表1 引物探針的名稱、序列及靶基因

1.2.2 熒光定量PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化 用ROCHE480 設(shè)備進(jìn)行反應(yīng)體系優(yōu)化，對(duì)反應(yīng)參數(shù)、各種成分的濃度進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3 靈敏度試驗(yàn) 應(yīng)用建立的反應(yīng)體系，對(duì)人工合成的含101～105基因拷貝的PCV2 DNA 進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證方法的靈敏度。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用建立的反應(yīng)體系，對(duì)豬瘟病毒HCLV cDNA、 偽狂犬病毒Nanyangju核酸、 豬繁殖與呼吸綜合征病毒MLV RespPRRS/Repro cDNA、豬傳染性胃腸炎病毒Purdue115 cDNA、PCV2 QD 株DNA 進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證方法的特異性。

1.2.5 送檢樣品檢測(cè) 應(yīng)用建立的方法，對(duì)北京市順義區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所送檢的總計(jì)45 份病死豬臟器樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2708—2010 推薦的套式PCR 方法進(jìn)行比較[5]。

1.2.6 PCR 擴(kuò)增強(qiáng)陽(yáng)性樣品全基因序列 使用表1中的引物對(duì)PCV2-F/PCV2-R，進(jìn)一步對(duì)分屬2 批次的3 份樣品進(jìn)行擴(kuò)增。采用50 μL 體系，每個(gè)反應(yīng)體系均包含1×PCR Buffer、3.0 mmol/L MgCl2、200 nmol/L dNTP、0.8 μmol/L 的PCV2-F/ PCV2-R引物、2.5 U Taq DNA 聚合酶、5 μL 模板DNA。反應(yīng)參數(shù)為95 °C/3 min；94 °C/30 s，61 °C/30 s，72 °C/min，40 個(gè)循環(huán)；72 °C 最后延伸10 min。擴(kuò)增后取PCR 產(chǎn)物5 μL 用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。1.2.7 目的片段克隆、測(cè)序 將PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目的片段，按照說(shuō)明書(shū)克隆入pGEM-T 載體，轉(zhuǎn)化Top10 感受態(tài)細(xì)胞，每個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒各挑取3 個(gè)克隆進(jìn)行序列測(cè)定。對(duì)ORF2 基因序列和推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行變異分析，將測(cè)定獲得的3 個(gè)全基因序列與NCBI 選取的21株代表性PCV2（涵蓋PCV2a、PCV2b、PCV2c 以及PCV2d）全基因序列對(duì)比，使用MEGA 4.0 繪制進(jìn)化樹(shù)，確定測(cè)定序列的基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

經(jīng)優(yōu)化確立反應(yīng)體系：每個(gè)反應(yīng)體系均包含1×Ex Taq HS PCR Buffer、200 nmol/L dNTP、0.2 μmol/L 的PCV2-BF/PCV-BR 引 物、0.1 μmol/L的PCV2-P 檢測(cè)探針。反應(yīng)參數(shù)為95 °C /3 min，94 °C/10 s，60 °C/30 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)60 °C時(shí)收集熒光信號(hào)。

2.2 靈敏度試驗(yàn)

應(yīng)用建立的反應(yīng)體系可以檢出10 拷貝的病毒DNA，表明方法的靈敏度可以滿足要求（圖2）。

2.3 特異性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的反應(yīng)體系檢測(cè)，對(duì)豬瘟病毒HCLV cDNA、偽狂犬病毒Nanyangju 核酸、豬繁殖與呼吸綜合征病毒MLV RespPRRS/Repro cDNA、豬傳染性胃腸炎病毒Purdue115 cDNA、PCV2 QD 株DNA 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)建立的檢測(cè)方法僅能檢出PCV2 QD 株DNA。

圖2 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 送檢樣品檢測(cè)

應(yīng)用熒光PCR 檢測(cè)方法，從2 批次45 份病死豬臟器中檢出25 份陽(yáng)性，與基于凝膠電泳的套式PCR 方法比較發(fā)現(xiàn)，僅有2 份樣品的檢測(cè)結(jié)果不一致，兩種檢測(cè)方法的復(fù)合率為95.6%。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品檢測(cè)結(jié)果 單位：份

2.5 強(qiáng)陽(yáng)性樣品病毒基因組擴(kuò)增與克隆

對(duì)3 份強(qiáng)陽(yáng)性樣品采用PCV2-F 和PCV2-R 引物，經(jīng)PCR 擴(kuò)增了全長(zhǎng)PCV2 基因組DNA，（圖3）并將其克隆入pGEM-T 載體，質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)化Top 10 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR 鑒定后，證明3個(gè)PCV2 基因組DNA 成功克隆入質(zhì)粒載體，分別命 名 為pGEM-T-PCV25101、pGEM-T-PCV21201和pGEM-T-PCV215102。

圖3 3 個(gè)樣品PCV2 基因組DNA 擴(kuò)增結(jié)果

2.6 序列測(cè)定與變異分析

測(cè)序結(jié)果經(jīng)blast 分析顯示，目的片段均為PCV2 DNA，與預(yù)期一致，長(zhǎng)度均為1 768 nt。其 中：PCV21201 和PCV215102 序 列 相 似 性 較高，為99.7%；PCV25101 與其他2 個(gè)全基因序列差異相對(duì)較大，序列相似性分別為95.9%和95.7%。對(duì)ORF2 推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，同樣是PCV21201 和PCV215102 序列相似性較高，為99.1%；PCV25101 與其他2 個(gè)全基因序列差異相對(duì)較大，序列相似性分別為94.4%和93.6%，因末端T 突變?yōu)镃，導(dǎo)致終止密碼子后移，編碼的氨基酸比PCV21201 和PCV215102 多出1 個(gè)賴氨酸（圖4）。

2.7 進(jìn)化分析和親緣性分析

圖4 ORF2 推導(dǎo)氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

將測(cè)定獲得的3 個(gè)全基因序列與NCBI選 取 的21 株 代 表 性PCV2（ 涵 蓋PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d）全 基 因 序 列，使用MEGA 4.0 繪制進(jìn)化樹(shù)，確定測(cè)定序列的基因型。結(jié)果顯示：PCV21201 和PCV215102基 因 型 為PCV2b， 而PCV25101 基 因 型 為PCV2d（圖5）。

圖5 24 個(gè)PCV2 全基因序列的進(jìn)化分析結(jié)果（包括本研究獲得的3 個(gè)序列）

3 討論

近十多年來(lái)，PCV2 感染對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，有關(guān)PCV2 的檢測(cè)和病毒基因變異研究在全球廣泛開(kāi)展。但國(guó)內(nèi)有關(guān)PCV2 基因變異的研究還不是很多。因此在日常檢疫工作中，對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的基因序列進(jìn)行分析，不僅能確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果，而且對(duì)充分了解國(guó)內(nèi)PCV2 的變異具有一定意義，也有助于豬圓環(huán)病毒病的防控。

本研究中，與隨機(jī)選取國(guó)內(nèi)外流行的3 個(gè)基因型（PCV2a、PCV2b 和PCV2d）毒株序列進(jìn)行比對(duì)，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)通用型引物探針，建立和優(yōu)化反應(yīng)體系，并評(píng)估其敏感性和特異性，并用于送檢樣品的檢測(cè)。從2 批次45 份病死豬臟器中檢出25 份陽(yáng)性，與出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的套式PCR 方法比較，復(fù)合率達(dá)到95.6%。由于PCV2c僅在上世紀(jì)80 年代在丹麥有報(bào)道，目前沒(méi)有流行，因此在建立方法時(shí)并未參考該基因型的毒株序列。但考慮到目前相關(guān)熒光PCR 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)目標(biāo)也未針對(duì)PCV2c，下一步開(kāi)展能覆蓋4 個(gè)基因型毒株的熒光PCR 方法用于本病的檢測(cè)對(duì)于本病的防控檢測(cè)會(huì)更有意義。此外，從2 批次的3 份PCV2 強(qiáng)陽(yáng)性樣品中擴(kuò)增了3 個(gè)全基因序列，經(jīng)序列分析顯示，2 個(gè)批次中獲得的3 個(gè)全序列中，1個(gè)（第2 批次）與另外2 個(gè)（第1 批次）差異明顯，分別屬于PCV2b 和PCV2d。

ORF2 編碼的Cap 蛋白是PCV2 的主要結(jié)構(gòu)蛋白和保護(hù)性抗原，盡管該蛋白基因相對(duì)保守，但近年來(lái)不斷發(fā)生變異。該基因的變異可導(dǎo)致蛋白C末端多出1～2 個(gè)氨基酸。Knell 等[6]曾報(bào)道1 042處缺失1 個(gè)T 可致蛋白C 末端多出1 個(gè)賴氨酸。Olvera 等[7]報(bào)道ORF2 終止密碼子的突變也可導(dǎo)致C 末端多出1 個(gè)賴氨酸，Guo[4]等也發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。本研究通過(guò)全基因測(cè)序鑒定出了PCV2d 基因型序列。該基因型病毒株ORF2 的一個(gè)堿基突變，致長(zhǎng)度發(fā)生改變，與上述研究結(jié)果一致。此變異與病毒致病性的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。