包汭琪 吳香瑩 劉灑灑 謝同舟 高 寧 林心萍

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心 遼寧大連 116034）

微生物油脂，又稱為單細(xì)胞油脂，是指在一定條件下酵母、細(xì)菌、霉菌和藻類等微生物通過利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭忍荚?，所積累的大量油脂[1-2]。對(duì)于微生物油脂的早期研究主要集中在γ-亞麻酸（GLA）[3]、花生四烯酸（ARA）[4]、二十碳五烯酸（EPA）[5]、二十二碳六烯酸（DHA）[5]等功能性油脂的開發(fā)上[6]。有文獻(xiàn)表明，微生物油脂是化石能源的理想替代品，它不僅可再生，而且還可作為食用油脂[7-8]。近年來由于化石能源供應(yīng)逐漸緊張，使微生物油脂得到廣泛關(guān)注[9]。為節(jié)約成本，目前大多數(shù)研究以低成本天然原料如菊芋水解液[10]、木質(zhì)纖維素水解液[11]或氨基酸工業(yè)廢水[12]等為底物，且多采用氮元素限制來調(diào)控微生物油脂產(chǎn)量[13-14]，然而，這些原料碳氮比較低，脫氮較為困難。開發(fā)限氮之外的調(diào)控方式具有較好的前景。

硫（S）在微生物細(xì)胞生長(zhǎng)及生理代謝活動(dòng)中扮演重要角色[15]，參與合成諸多輔酶如生物素、輔酶A、S-腺苷甲硫氨酸、硫胺素、硫辛酸和鐵硫簇合[16]。有研究表明，微生物發(fā)酵過程中硫元素的限制供應(yīng)會(huì)直接影響細(xì)胞增殖[17-18]，從而攝取更多的碳元素并將其轉(zhuǎn)化為油脂儲(chǔ)存在微生物細(xì)胞內(nèi)。Wu等[19]以葡萄糖為碳源，對(duì)Rhodosporidium toruloides（圓紅冬孢酵母）Y4進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中 n（C）/n（N）為 28.3～5.7 且 n（C）/n（S）為11 380時(shí)油脂含量基本穩(wěn)定在57%左右，這表明無論培養(yǎng)基中是否存在較高的 n（C）/n（N），硫元素的限制都會(huì)有效提升菌體中的油脂含量。王雅南等[20]以葡萄糖為碳源，對(duì)圓紅冬孢酵母AS 2.1389進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)硫元素限制能提高胞內(nèi)油脂得率和油脂含量，使圓紅冬孢酵母在胞內(nèi)積累高于干重60%的微生物油脂。然而，硫元素限制是否適用于果糖為碳源的培養(yǎng)情況，尚未有文獻(xiàn)研究。本研究以粘性絲孢酵母CICC 1368為目標(biāo)菌株，考察了培養(yǎng)基中硫元素的限量供應(yīng)對(duì)果糖轉(zhuǎn)化為油脂的影響，為后期基于天然底物發(fā)酵的微生物油脂的工業(yè)化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 粘性絲孢酵母（Trichosporon fermentans）CICC 1368購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母粉 10 g/L，pH 6.0。

限硫培養(yǎng)基：果糖 70 g/L，MgCl2·6H2O 1.5 g/L，NH4Cl 5.42 g/L，Na2HPO41.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，痕量元素溶液10 mL/L。以Na2SO4為硫元素的添加，質(zhì)量濃度分別為 2.0，1.0，0.5，0.1，0.05和0.01 g/L，pH 6.0。

最優(yōu)限硫培養(yǎng)基：果糖 70 g/L，MgCl2·6H2O 1.5 g/L，NH4Cl 5.42 g/L，Na2HPO41.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，Na2SO40.1 g/L，痕量元素溶液 10 mL/L，pH 6.0。

痕量元素溶液配方：CaCl2·2H2O 4.0 g/L，水合檸檬酸 0.52 g/L，F(xiàn)eSO4·7H20 0.55 g/L，MnSO4·H2O 0.076 g/L，ZnSO4·7H2O 0.10 g/L，100 μL 18 mol/L H2SO4。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵試驗(yàn) 將活化的酵母菌接種于50 mL種子培養(yǎng)基中，200 r/min，28℃培養(yǎng)24 h。7 800 g離心8 min，0.9%無菌生理鹽水清洗兩次后用50 mL的0.9%無菌生理鹽水將菌體重懸。種子液以10%（V/V）接種量接種于45 mL生產(chǎn)培養(yǎng)基中，200 r/min，28℃培養(yǎng)，每24 h用2 mol/L鹽酸和1 mol/L氫氧化鈉將pH調(diào)至5～7左右，至任意一組碳源被充分利用時(shí)結(jié)束發(fā)酵。

1.2.2 菌體生物量的測(cè)定[21]取一定體積的發(fā)酵液，于8 000 g離心5 min，去除上清后用去離子水清洗兩次，105℃下將菌體烘干至恒重，對(duì)菌體生物量進(jìn)行計(jì)算（g/L）。

1.2.3 殘?zhí)堑臏y(cè)定[22]采用DNS法對(duì)培養(yǎng)基中果糖的剩余量進(jìn)行測(cè)定。取1 mL發(fā)酵液和1 mL DNS試劑混合，沸水浴5 min，冷卻后加入8 mL蒸餾水，混勻后于540 nm處測(cè)其吸光度值。標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y=1.4993x-0.0347（R2=0.999）。

1.2.4 低場(chǎng)核磁檢測(cè)微生物油脂含量 將發(fā)酵后的菌體離心，收集沉淀，干燥至恒重，制得干菌體樣品；利用低場(chǎng)核磁共振對(duì)各樣品的低場(chǎng)核磁CPMG衰減曲線信號(hào)進(jìn)行收集，具體參數(shù)設(shè)置如下：90 度脈寬 P1：13 μs；180 度脈寬 P2：24 μs；重復(fù)采樣等待時(shí)間 Tw：2 000 ms；模擬增益 RG1：10；數(shù)字增益 DRG1：3；前置放大增益 PRG：2；重復(fù)采樣次數(shù) NS：32；回?fù)軅€(gè)數(shù) NECH：2 000；接收機(jī)帶寬SW：200，300 kHz；開始采樣時(shí)間的控制參數(shù)RFD：0.02 ms；時(shí)延 DL1：0.2 ms進(jìn)行核磁共振信號(hào)采集。將收集的CPMG衰減曲線信號(hào)除以各樣品的實(shí)際質(zhì)量，并對(duì)應(yīng)時(shí)間進(jìn)行作圖，獲得單位質(zhì)量油脂的低場(chǎng)核磁CPMG信號(hào)，對(duì)菌體中的油脂進(jìn)行初步預(yù)估。

1.2.5 油脂的提取 采用酸熱法[23]，每克菌體加入10 mL 4.0 mol/L鹽酸，于78℃水浴消化1.5 h。冰浴冷卻后加入2倍體積的氯仿/甲醇溶劑（1∶1，V/V），充分振蕩 1 h，于 8 000 r/min 離心 5 min，收集下層有機(jī)相。上層溶液加入等體積的氯仿，充分振蕩1 h，8 000 r/min離心5 min，收集有機(jī)相。合并有機(jī)相，加入等體積的0.1%氯化鈉溶液去乳化，充分混勻后于8 000 r/min離心5 min。用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，105℃烘干至恒重。以 g/L（每升發(fā)酵液中含油脂的克數(shù)）表示油脂量；油脂含量為油脂量占生物量的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)；油脂得率為每克糖所生成的油脂質(zhì)量。

1.2.6 菌油脂肪酸組分分析 脂肪酸甲酯化處理：取油脂約0.1 g，加入2 mL 0.5 mol/L氫氧化鉀/甲醇溶液，于60℃水浴2 h。冷卻后用6 mol/L鹽酸將pH調(diào)節(jié)至低于1.0，用10 mL正己烷進(jìn)行萃取，然后氮吹至恒重，再加1 mL正己烷和2 mL甲基化試劑，于70℃水浴1 h，冷卻后移出正己烷層并將其水洗至中性，用無水硫酸鈉過夜干燥。

樣品采用安捷倫6890N GC-5973 MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）分析。HP-5-MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣。分析條件：50℃，保持1 min，以50℃/min升至170℃，然后以4℃/min升至300℃，隨后以40℃/min升到320℃，保持3.6 min，采用全掃描模式，離子源采用EI源（70 eV），溶劑延遲 4 min，掃描范圍為50～550 m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 低場(chǎng)核磁共振檢測(cè)不同濃度的硫酸鹽下粘性絲孢酵母中油脂含量

首先采用低場(chǎng)核磁共振對(duì)培養(yǎng)基中不同濃度的硫酸鹽下粘性絲孢酵母的油脂信號(hào)進(jìn)行測(cè)定，并換算為單位質(zhì)量油脂信號(hào)響應(yīng)，由此來快速檢測(cè)各樣品中油脂含量的差異。本試驗(yàn)通過調(diào)節(jié)Na2SO4的添加量，設(shè)置 6 種不同 n（C）/n（S）的培養(yǎng)基，形成 n（C）/n（S）分別為 180，331，662，3 310，6 619和33 095的6種培養(yǎng)環(huán)境。如圖1所示，在含有 2.0，1.0，0.5 g/L Na2SO4的合成培養(yǎng)基中，單位質(zhì)量菌體中油脂的CPMG信號(hào)無明顯差異，且低于含 0.1，0.05，0.01 g/L Na2SO4的合成培養(yǎng)基。該結(jié)果表明，n（C）/n（S）的提高，會(huì)進(jìn)一步提升粘性絲孢酵母的油脂積累能力。以上結(jié)果說明低場(chǎng)核磁共振可作為一種快速預(yù)估油脂含量的有效手段。劉婷婷等[24]也利用了低場(chǎng)核磁共振技術(shù)對(duì)小球藻中的油脂含量進(jìn)行快速檢測(cè)，其信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞中的油脂含量存在線性關(guān)系，擬合度R2大于0.99，證實(shí)此快速檢測(cè)技術(shù)是可行的。因此，低場(chǎng)核磁檢測(cè)技術(shù)未來可作為一種快速無損的微生物油含量分析檢測(cè)技術(shù)手段。

圖1 粘性絲孢酵母CICC 1368在不同Na2SO4濃度下培養(yǎng)后的微生物油脂含量CPMG衰減曲線分析Fig.1 Lipid content CPMG decay curve analysis of T.fermentans CICC 1368 in the presence of various amounts of Na2SO4

2.2 不同濃度的硫酸鹽對(duì)粘性絲孢酵母生長(zhǎng)及產(chǎn)油的影響

為進(jìn)一步了解不同濃度的硫酸鹽對(duì)粘性絲孢酵母生長(zhǎng)及產(chǎn)油的影響，對(duì)各組樣品的生物量、殘?zhí)?、油脂產(chǎn)量等進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示，隨著培養(yǎng)基中硫元素濃度的降低，生物量呈逐漸下降的趨勢(shì)，表明硫元素缺乏時(shí)，并不利于菌體繁殖。從油脂含量結(jié)果中還可看出粘性絲孢酵母在添加了0.1，0.05，0.01 g/L Na2SO4的合成培養(yǎng)基中的油脂含量高于添加了2.0，1.0，0.5 g/L Na2SO4的合成培養(yǎng)基，這與低場(chǎng)核磁共振結(jié)果相吻合。此外，隨著培養(yǎng)基中 n（C）/n（S）的升高，菌體油脂含量呈持續(xù)上升趨勢(shì)，從12.4%上升到50.0%，說明硫元素限制會(huì)使更多碳代謝流轉(zhuǎn)向油脂合成，從而使干菌體中油脂含量增加。但當(dāng)n（C）/n（S）超過3 310后，菌體油脂含量雖呈持續(xù)增加，但生物量卻明顯下降，油脂生產(chǎn)量也從8.9 g/L下降至3.1 g/L，油脂生產(chǎn)強(qiáng)度同樣呈下降趨勢(shì)，降至0.026 g/L/h，油脂得率降至0.121 g/g糖。此外，殘?zhí)浅尸F(xiàn)上升趨勢(shì)，推測(cè)可能由于過度硫限制抑制了菌體的生長(zhǎng)，從而影響了其對(duì)底物的利用。Wu等[19]也在研究中發(fā)現(xiàn)硫元素限制條會(huì)使圓紅冬孢酵母Y4中油脂產(chǎn)量及油脂得率大幅度升高，但過度限制硫元素也會(huì)使油脂產(chǎn)量下降。本試驗(yàn)通過考察不同濃度硫元素對(duì)粘性絲孢酵母產(chǎn)油影響，表明硫元素限制能有效提高產(chǎn)油酵母油脂的積累，但是硫元素的調(diào)控必須控制在一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。

表1 不同濃度的Na2SO4條件下粘性絲孢酵母生長(zhǎng)及產(chǎn)油結(jié)果Table 1 Conditions and results of lipid produced by T.fermentans CICC 1368

2.3 不同濃度的硫酸鹽對(duì)粘性絲孢酵母油脂成分的影響

采用 GC-MS 對(duì)不同 n（C）/n（S）培養(yǎng)條件下所得的油脂樣品進(jìn)行分析，粘性絲孢酵母油脂中脂肪酸成分結(jié)果如表2所示，油酸（C18：1）為主要脂肪酸，而硬脂酸（C18：0）、棕櫚酸（C16：0）和亞油酸（C18：2）所占比例也較大，這4種脂肪酸含量的總和基本超過脂肪酸總量的90%，分別在Na2SO4的添加量為 0.1，0.05，1.0，0.5 g/L時(shí)含量最高，分別為54.94%，26.55%，25.62%，10.91%。此外，硫元素的限制對(duì)飽和脂肪酸肉豆蔻酸（C14：0）、花生酸（C20：0）、山萮酸（C22：0）和木蠟酸（C24：0）含量的影響較小，且它們的含量始終處于較低水平。從表2中還可看出除了Na2SO4的添加量為1.0 g/L時(shí)，其余條件下不飽和脂肪酸總含量均高于飽和脂肪酸總含量，且隨 n（C）/n（S）的升高，不飽和脂肪酸總含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在Na2SO4的添加量為0.1 g/L時(shí)，不飽和脂肪酸總含量達(dá)到最高，為57.44%，若繼續(xù)降低Na2SO4濃度，不飽和脂肪酸總含量開始降低，說明培養(yǎng)基中適當(dāng)硫元素才會(huì)有利于不飽和脂肪酸的積累，其中含量最高的不飽和脂肪酸為油酸，它同樣在Na2SO4的添加量為0.1 g/L時(shí)含量達(dá)到最大，為54.94%。微生物油脂中的長(zhǎng)鏈脂肪酸組分和植物油相似[25]，表明粘性絲孢酵母在限硫條件下所積累的微生物油脂可能作為生物柴油的原料。

表2 不同濃度的Na2SO4條件下粘性絲孢酵母脂肪酸成分分析Table 2 Fatty acid compositions of the total lipid produced by T.fermentans CICC 1368 in different Na2SO4levels

2.4 最優(yōu)限硫條件下粘性絲孢酵母油脂積累過程

為了更好地理解硫元素限制條件下的油脂生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)，我們對(duì)最適 n（C）/n（S）條件下粘性絲孢酵母的生長(zhǎng)和產(chǎn)油過程進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，底物在120 h被消耗完，殘?zhí)菫? g/L。培養(yǎng)過程中，粘性絲孢酵母的生物量持續(xù)增加，發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)為21.1 g/L。粘性絲孢酵母的油脂產(chǎn)量在72 h前呈緩慢上升趨勢(shì)，72 h后上升趨勢(shì)顯著，到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)其油脂產(chǎn)量達(dá)到最大，為9.0 g/L。其油脂含量和油脂產(chǎn)量趨勢(shì)相似，發(fā)酵終點(diǎn)干菌體油脂含量達(dá)到最大，為42.3%。油脂產(chǎn)量和干菌體油脂含量出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因，可能是前72 h粘性絲孢酵母碳代謝流多流向了細(xì)胞生長(zhǎng)方向，而培養(yǎng)72 h后碳代謝流更多地流向了油脂合成的方向。

圖2 Trichosporon fermentans CICC 1368碳源消耗、細(xì)胞增長(zhǎng)和油脂積累動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Carbon source consumption，cell growth and lipid accumulation of Trichosporon fermentans CICC 1368

3 結(jié)論

采用硫元素限制對(duì)粘性絲孢酵母的油脂積累進(jìn)行調(diào)控。油脂提取結(jié)果及核磁分析結(jié)果均表明，適當(dāng)?shù)靥岣吲囵B(yǎng)基的n（C）/n（S）能夠促進(jìn)微生物的油脂積累，且低場(chǎng)核磁共振可作為一種分析微生物油脂含量的有效手段。油脂含量和油脂得率會(huì)隨著 n（C）/n（S）的增加，呈先上升后下降的趨勢(shì)。脂肪酸成分分析結(jié)果表明，菌油中油酸含量最高，棕櫚酸、硬脂酸以及亞油酸也占較大比重。n（C）/n（S）對(duì)脂肪酸的組成影響不大，但對(duì)于脂肪酸的含量會(huì)有一定的影響，適當(dāng)?shù)叵拗屏蛟貢?huì)促進(jìn)總不飽和脂肪酸的積累。因此可通過對(duì)硫元素的調(diào)控，直接調(diào)控菌油的脂肪酸含量。綜合考慮以上試驗(yàn)的結(jié)果得出，3 310 為最適 n（C）/n（S），粘性絲孢酵母在該條件下培養(yǎng)120 h后，生物量可達(dá)到21.1 g/L，油脂產(chǎn)量可達(dá)到9.0 g/L、干菌體油脂含量可達(dá)到42.3%。本研究限硫條件下微生物油脂的積累提供了理論依據(jù)。