張良晨，李東紅，于淼，劉曉晶

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品與加工研究所，遼寧沈陽110161；2.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州121013；3.遼寧省疾病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽110005）

糙米在發(fā)芽過程中由于內(nèi)源酶的激活富集了一些對人體有特殊功效的功能因子，如六磷酸肌醇、谷維素、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、阿魏酸、谷胱甘肽等，其中以GABA 最為引人關(guān)注[1]。GABA是一種非蛋白質(zhì)類氨基酸，在各類生物體內(nèi)均有分布[2]，它是生物三羧酸循環(huán)中支路反應(yīng)的中間產(chǎn)物[3]。在植物體內(nèi)GABA 的作用是調(diào)控植物的生長發(fā)育，保證碳源與氮源的穩(wěn)定及信號的傳遞，在植物種子發(fā)芽過程中會成倍增加[4-6]。GABA 對于人體有著重要的生理作用，可以通過調(diào)節(jié)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，達(dá)到降低血壓，舒緩血管的作用，醫(yī)學(xué)臨床試驗已經(jīng)證明，GABA 可以抑制腫瘤細(xì)胞中端粒酶的活性，從而控制腫瘤細(xì)胞增殖惡化，達(dá)到抗癌、抗腫瘤的功效[7]。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽糙米的GABA 的含量對比于糙米原料可以增長 2 倍～3 倍，是精白米的 10 倍[8]。

糙米原料帶菌情況復(fù)雜，在發(fā)芽糙米生產(chǎn)過程中極易受到腐敗微生物的侵染，使發(fā)芽糙米產(chǎn)品帶上令人不愉快的氣味。目前，主要采用的方抑菌方法是在糙米浸泡液中加入化學(xué)殺菌劑，在發(fā)芽糙米干燥前用大量的清水沖洗[9-10]，此種方法耗水量大、成本高、并且存在食品安全問題。脈沖強(qiáng)光殺菌技術(shù)起源于上世紀(jì)70年代，它利用瞬時、高強(qiáng)度的脈沖形式光能殺滅食品表面各類微生物[11]，它是一種物理殺菌方法，具有高效節(jié)能、易于實現(xiàn)機(jī)械化、自動化，無二次污染等優(yōu)點，在食品領(lǐng)域已經(jīng)應(yīng)用于乳制品等包裝的表面殺菌[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)通過脈沖強(qiáng)光的照射能夠大大增強(qiáng)植物種子中谷氨酸脫羧酶的活性[14]，谷氨酸脫羧酶是植物中催化谷氨酸生成GABA 的內(nèi)源酶[15]，糙米中谷氨酸脫羧酶活性的增強(qiáng)能夠大大增加發(fā)芽糙米GABA 的富集量，對比于未經(jīng)脈沖強(qiáng)光照射的發(fā)芽糙米，其GABA 的富集量可增長30%以上[16]。因此將脈沖強(qiáng)光殺菌技術(shù)應(yīng)用于發(fā)芽糙米生產(chǎn)中不僅能夠殺滅污染發(fā)芽糙米的腐敗微生物，而且能夠達(dá)到富集GABA 的目的。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以脈沖強(qiáng)光光照強(qiáng)度、照射次數(shù)、照射距離為響應(yīng)因素，以發(fā)芽糙米滅菌率、GABA 富集量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面雙響應(yīng)值聯(lián)合分析法探討發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光殺菌耦合GABA 富集技術(shù)，以期為脈沖強(qiáng)光技術(shù)應(yīng)用于發(fā)芽糙米生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

糙米：鹽豐 47（GABA 含量為 46.07 mg/100 g），中稻股份有限公司。

1.2 試驗試劑

GABA 標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma 公司；營養(yǎng)培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司；次氯酸鈉、重蒸苯酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硼砂、無水乙醇均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗設(shè)備

BSA124S 電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司；QC200 恒溫水浴鍋、80-1 型離心機(jī)：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；UV1200 型紫外可見分光光度計：上海正慧工貿(mào)有限公司；WI6086 型打漿機(jī)：西儀科技有限公司；XMT-152A 型電烘箱：溫州龍興機(jī)械廠；LDZX-30FA型滅菌鍋：蘇州奇樂電子科技有限公司；SW-CJ-lF 型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 發(fā)芽糙米的制備

參考袁建等[17]的方法，并加以改進(jìn)。浸泡溫度30℃，浸泡液pH5.5，浸泡時間12 h，發(fā)芽溫度32 ℃，發(fā)芽時間24 h。

1.4.2 發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光處理

發(fā)芽糙米受腐敗微生物侵染主要發(fā)生在糙米浸泡階段[18]，在糙米浸泡吸水飽和后進(jìn)行脈沖強(qiáng)光處理。

1.4.3 糙米發(fā)芽微生物測定

采用范軍等[19]的方法。

1.4.4 GABA 含量測定

糙米浸泡后進(jìn)行脈沖強(qiáng)光處理，按1.4.1 方法發(fā)芽后測定GABA 含量，測定方法采用蔣靜等[20]的方法。

1.4.5 發(fā)芽糙米GABA 富集量計算

發(fā)芽糙米GABA 富集量=發(fā)芽糙米GABA 含量-糙米原料GABA 含量。

1.4.6 單因素試驗

以脈沖強(qiáng)光對發(fā)芽糙米的滅菌率以及通過脈沖強(qiáng)光處理后發(fā)芽糙米的GABA 富集量為考察目標(biāo)，以脈沖強(qiáng)光的光照強(qiáng)度、照射次數(shù)、照射距離為自變量進(jìn)行單因素試驗，考察脈沖強(qiáng)光各因素對于發(fā)芽糙米的滅菌率與GABA 富集效果。光照強(qiáng)度設(shè)定0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55 kJ，照射次數(shù)設(shè)定 200、250、300、350、400、450 次，照射距離設(shè)定 8、9、10、11、12、13 cm。

1.4.7 響應(yīng)面雙響應(yīng)值聯(lián)合優(yōu)化發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光殺菌耦合GABA富集工藝

在單因素試驗的基礎(chǔ)上以滅菌率、GABA 富集量為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗，因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗水平因素表Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.4.8 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.0.6 數(shù)據(jù)分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脈沖強(qiáng)光處理單因素試驗

2.1.1 光照強(qiáng)度對發(fā)芽糙米滅菌率及GABA 富集量的影響

脈沖強(qiáng)光光照強(qiáng)度對發(fā)芽糙米滅菌率與GABA富集量的影響見圖1。

圖1 脈沖強(qiáng)光光照強(qiáng)度對發(fā)芽糙米滅菌率與GABA 富集量的影響Fig.1 The effects of irradiation intensity of pulsed light on sterilization rate and enrichment of GABA of germinated brown rice

由圖1 可知，隨著光照強(qiáng)度的增加發(fā)芽糙米滅菌率逐步增高，當(dāng)光照強(qiáng)度達(dá)到0.4 kJ 時，其對應(yīng)的滅菌率顯著升高（p＜0.05），光照強(qiáng)度達(dá)到0.45 kJ 時滅菌率達(dá)到最大值90.41%，光照強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)其滅菌率趨于穩(wěn)定，光照強(qiáng)度為0.50 kJ 與0.55 kJ 時所對應(yīng)的發(fā)芽糙米滅菌率變化不顯著（p＞0.05）。造成這種現(xiàn)象的原因是脈沖強(qiáng)光作為一種光波物理殺菌技術(shù)對于物體的穿透性較差[21]，過低的照射能量不能有效穿透微生物的細(xì)胞膜，無法破壞微生物細(xì)胞內(nèi)溶物，因此達(dá)不到理想的殺菌效果。經(jīng)過不同光照強(qiáng)度脈沖強(qiáng)光處理后的糙米發(fā)芽后GABA 富集量呈上升趨勢，其增加幅度呈先增加后小幅度降低的趨勢，光照強(qiáng)度達(dá)到0.40 kJ 時，發(fā)芽結(jié)束后其GABA 富集量顯著增長（p＜0.05），其原因是照射能量過高對糙米中谷氨酸脫羧酶的活性有一定的抑制作用，導(dǎo)致GABA 富集量減少[22-23]。

2.1.2 照射次數(shù)對發(fā)芽糙米滅菌率及GABA 富集量的影響

照射次數(shù)對發(fā)芽糙米滅菌率及GABA 富集量的影響見圖2。

圖2 脈沖強(qiáng)光照射次數(shù)對發(fā)芽糙米滅菌率與GABA 富集量的影響Fig.2 The effects of irradiation frequency of pulsed light on sterilization rate and enrichment of GABA of germinated brown rice

由圖2 可知，當(dāng)照射次數(shù)超過300 次時，發(fā)芽糙米滅菌率增加明顯（p＜0.05），當(dāng)照射次數(shù)為 350、400、450次時，其滅菌率沒有明顯的變化。脈沖強(qiáng)光光照次數(shù)的增加能夠使發(fā)芽GABA 富集量穩(wěn)步增加，當(dāng)照射次數(shù)超過350 次后，相應(yīng)的發(fā)芽糙米GABA 富集量增漲顯著（p＜0.05）。以上試驗結(jié)果說明當(dāng)脈沖強(qiáng)光照射達(dá)到一定次數(shù)后對糙米的滅菌率提升有限，單純的增加脈沖強(qiáng)光照射次數(shù)并不能增強(qiáng)其滅菌效果，但脈沖強(qiáng)光照射次數(shù)與發(fā)芽糙米GABA 富集量之間存在著一定的正相關(guān)。

2.1.3 照射距離對發(fā)芽糙米滅菌率及GABA 富集量的影響

照射距離對發(fā)芽糙米滅菌率及GABA 富集量的影響見圖3。

圖3 脈沖強(qiáng)光照射距離對發(fā)芽糙米滅菌率與GABA 含量的影響Fig.3 The effects of irradiation distance of pulsed light on sterilization rate and enrichment of GABA of germinated brown rice

由圖3 可知，隨著照射距離的增加，糙米滅菌率呈先增加再降低的趨勢，當(dāng)照射距離為9 cm 時其滅菌率最高，達(dá)到89.02%，照射距離超過10 cm 后其滅菌率明顯下降（p＜0.05）。在一定的范圍內(nèi)，照射距離的增加能夠擴(kuò)大殺菌范圍，從而提高滅菌效果，但是照射距離的增加會造成照射能量的衰減，在超過一定照射距離后，脈沖強(qiáng)光能量衰減到一定程度對微生物細(xì)胞壁的穿透效果有限造成了滅菌率的降低。當(dāng)照射距離超過11 cm 后發(fā)芽后的糙米GABA 富集量明顯降低（p＜0.05），造成這一現(xiàn)象的原因與照射距離增加使脈沖強(qiáng)光能量衰減有關(guān)。

2.2 響應(yīng)面雙響應(yīng)值聯(lián)合優(yōu)化發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光殺菌耦合GABA 富集工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 組合設(shè)計，以發(fā)芽糙米滅菌率、GABA 富集量為響應(yīng)值，以脈沖強(qiáng)光的光照強(qiáng)度、照射次數(shù)、照射距離為自變量因素，進(jìn)行響應(yīng)面雙響應(yīng)值聯(lián)合試驗，優(yōu)化發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光殺菌耦合GABA 富集工藝，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 數(shù)據(jù)分析軟件對影響因素進(jìn)行編碼組合，具體試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及其試驗結(jié)果Table 2 Program and experimental results of response surface analysis

雙響應(yīng)值（滅菌率、GABA 富集量）所得回歸方程為：

滅菌率R1=91.28-0.11A+0.12B-0.72C+0.93AB-0.13AC+0.24BC-0.64A2-2.08B2-1.46C2；

GABA 富集量 R2=125.85+0.18A-0.18B-0.16C-0.02AB-0.32AC+0.63BC-1.15A2-3.75B2-0.78C2。

兩組回歸方程方差分析見表3 和表4。

表3 發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光滅菌率回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation for sterilization rate of germinated brown rice

續(xù)表3 發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光滅菌率回歸方程方差分析表Continue table 3 Analysis of variance for the regression equation for sterilization rate of germinated brown rice

表4 發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光GABA 富集量回歸方程方差分析表Table 4 Analysis of variance for the regression equation for enrichment of GABA of germinated brown rice

由表3、表4 可知，所設(shè)定的各因素對芽糙米脈沖強(qiáng)光滅菌率影響排序為A＞B＞C，即光照強(qiáng)度＞照射次數(shù)＞照射距離，三者對于芽糙米脈沖強(qiáng)光滅菌率影響均為極顯著，交互項AB、AC 對芽糙米脈沖強(qiáng)光滅菌率影響均為極顯著，其他項對芽糙米脈沖強(qiáng)光滅菌率均無顯著影響。所設(shè)定的各因素對發(fā)芽糙米GABA 富集量影響排序為A＞B＞C，即光照強(qiáng)度＞照射次數(shù)＞照射距離，其中光照強(qiáng)度對發(fā)芽糙米GABA 富集量影響極為顯著，照射次數(shù)對發(fā)芽糙米GABA 富集量影響顯著，交互項AB 對發(fā)芽糙米GABA 富集量影響顯著，其他項對發(fā)芽糙米GABA 富集量均無顯著影響。發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光滅菌率回歸模型p 值為0.000 3，發(fā)芽糙米GABA 富集量回歸模型p＜0.000 1，均達(dá)到及其顯著水平，失擬項均不顯著，說明了兩組回歸方程擬合度較好，在所選自變量范圍內(nèi)能夠很好的分析響應(yīng)值的變化，可以用于發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光殺菌耦合GABA 富集工藝的理論值預(yù)測。

2.2.2 相關(guān)變量間的交互作用

響應(yīng)面各因素交互作用對發(fā)芽糙米滅菌率的影響見圖4。

圖4 各因素交互作用對發(fā)芽糙米滅菌率的影響Fig.4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction parameters on sterilization rate

響應(yīng)面各因素交互作用對發(fā)芽糙米GABA 富集量的影響見圖5。

圖5 各因素交互作用對發(fā)芽糙米GABA 富集量的影響Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction parameters on enrichment of GABA of germinated brown rice

由圖4 可知，在本試驗條件下脈沖強(qiáng)光對發(fā)芽糙米的滅菌率為86.74%～92.98%，光照強(qiáng)度、照射次數(shù)、照射距離3 因素交互作用在3D 曲面圖上都存在極值，光照強(qiáng)度、照射次數(shù)二者的交互作用的極值最大，且曲面圖投影的等高線更接近于橢圓形，說明光照強(qiáng)度、照射次數(shù)二者的交互作用對于脈沖強(qiáng)光滅菌率的影響更加顯著，由圖4 中a、c 兩圖可以看出極值點對應(yīng)的照射距離均為9 cm，因此固定照射距離9 cm 可以縮小極值查找范圍，可選擇光照強(qiáng)度、照射次數(shù)二者的交互作用的等高線來展開接下來的分析。

由圖5 可知，在本試驗條件下發(fā)芽糙米GABA 富集量為123.07 mg/100 g～126.67 mg/100 g，各因素交互作用在3D 曲面圖上都存在最大響應(yīng)值，說明所選因素取值范圍對應(yīng)的試驗結(jié)果接近極值，通過響應(yīng)面分析能夠很好的預(yù)測試驗結(jié)果理論值。3 個3D 曲面圖的側(cè)面弧度顯示，光照強(qiáng)度與照射次數(shù)，光照強(qiáng)度與照射距離的弧度較大，且投影等高線均為橢圓形，說明光照強(qiáng)度與照射次數(shù)的交互作用與光照強(qiáng)度與照射距離的交互作用對發(fā)芽糙米GABA 富集量有比較顯著的影響，照射距離與照射次數(shù)交互作用對于發(fā)芽糙米GABA 富集量的影響不明顯。由圖5 中a、c 兩圖可以看出極值點對應(yīng)的照射距離取值均為9 cm，聯(lián)系上段分析結(jié)果可以確定光照強(qiáng)度與照射次數(shù)兩因素對于兩個響應(yīng)面都有較強(qiáng)的影響，且二者的交互作用對于試驗結(jié)果也有較強(qiáng)的顯著性，因此可以將兩因素對發(fā)芽糙米滅菌率、GABA 富集量的交互作用曲面圖進(jìn)行疊加，分析兩因素對于發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光殺菌耦合GABA 富集技術(shù)相關(guān)度的分析，縮小最優(yōu)區(qū)域取值范圍。

2.2.3 雙響應(yīng)值聯(lián)合優(yōu)化發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光殺菌耦合GABA 富集工藝

發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光殺菌耦合GABA 富集曲面疊加圖見圖6。

圖6 發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光殺菌耦合GABA 富集優(yōu)化曲面疊加圖Fig.6 Superposition graph of contour plots for sterilization coupling GABA enrichment by pulsed light treatment

由圖6 中的曲面可知光照強(qiáng)度、照射次數(shù)與雙響應(yīng)值呈正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)為0.813，通過Design-Expert 8.0.6 數(shù)據(jù)分析軟件預(yù)測雙響應(yīng)值的最優(yōu)解，最后確定脈沖強(qiáng)光最佳工藝參數(shù)為：光照強(qiáng)度0.448 kJ，照射次數(shù)395 次，照射距離9.012 cm，在此條件下，發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光滅菌率預(yù)測值為91.28%，GABA 富集量預(yù)測值為125.85 mg/100 g，為方便操作對預(yù)測最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行修改，選擇光照強(qiáng)度0.45 kJ，照射次數(shù)395 次，照射距離9.0 cm，作為發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光殺菌耦合GABA 富集的最優(yōu)工藝參數(shù)。

2.3 最優(yōu)工藝參數(shù)驗證試驗

設(shè)定脈沖強(qiáng)光參數(shù)光照強(qiáng)度0.45 kJ，照射次數(shù)395 次，照射距離9.0 cm，進(jìn)行驗證試驗。結(jié)果表明，在此條件下發(fā)芽糙滅菌率為91.15 %，GABA 含量為170.10 mg/100 g，GABA 富集量為 124.03 mg/100 g，分別達(dá)到了預(yù)測值的99.86%與98.55%，試驗實測值與預(yù)測值接近，所得脈沖強(qiáng)光最優(yōu)工藝參數(shù)可靠。

3 結(jié)論

以脈沖強(qiáng)光光照強(qiáng)度、照射次數(shù)、照射距離為響應(yīng)因素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上以滅菌率、GABA 富集量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面雙響應(yīng)值聯(lián)合分析法優(yōu)化發(fā)芽糙米脈沖強(qiáng)光殺菌耦合GABA 富集工藝，最后得出脈沖強(qiáng)光處理最優(yōu)工藝為：照強(qiáng)度0.45 kJ，照射次數(shù)395 次，照射距離9.0 cm，在此條件下發(fā)芽糙米滅菌率為91.15%，發(fā)芽糙米γ-氨基丁酸含量為170.10 mg/100 g，γ-氨基丁酸富集量為124.03 mg/100 g。