虞亞杰，梁 超，王尚乾，邵鵬飛

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京 210029)

四跨膜蛋白家族(tetraspanins)是一種膜蛋白，參與正常的生理過程(比如細(xì)胞的活化、增殖、粘附和運(yùn)動(dòng))，同時(shí)也參與病理過程(比如腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移)[1]。CD151作為四跨膜蛋白家族中的一員，已被證實(shí)在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌等腫瘤組織中高表達(dá)[2-7]。已有文獻(xiàn)報(bào)道高表達(dá)的CD151和腫瘤的生長(zhǎng)、進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[8-10]。然而，目前關(guān)于CD151和腎癌之間關(guān)系的研究很少，其在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用還不明確。本研究擬探討CD151對(duì)腎透明細(xì)胞癌的細(xì)胞遷移侵襲能力的影響及其相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料人腎透明細(xì)胞癌皮膚轉(zhuǎn)移細(xì)胞Caki-1，人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞Caki-2和人腎腺癌細(xì)胞786-0以及人腎小管上皮細(xì)胞HK-2(中國科學(xué)院生化細(xì)胞所)；DMEM、M5A、1640培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco公司，美國)；胰酶(Sigma公司，美國)；磷酸鹽緩沖液(Thermo Fisher Scientific公司，美國)；SiLent Fect Lipid Reagent 轉(zhuǎn)染試劑(Bio-Rad公司，美國)；siRNA-CD151及對(duì)照siRNA(Control siRNA)(蘇州吉瑪公司)；CD151抗體(Sigma公司，美國)；E-cad、N-cad和Vimentin抗體及山羊抗兔熒光二抗(CST公司，美國)；Transwell小室(Corning公司，美國)；Matrigel基質(zhì)膠(BD Biosciences公司，美國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，含10%胎牛血清的M5A培養(yǎng)基培養(yǎng)Caki-1和Caki-2細(xì)胞，含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)786-0細(xì)胞。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Caki-1、Caki-2細(xì)胞，按每孔1×106個(gè)細(xì)胞分別接種在6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到50%融合度時(shí)按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，各分為兩組，轉(zhuǎn)染CD151特異性siRNA組(siCD151組)和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA組(siCtrl組)。培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，24 h內(nèi)更換新鮮完全培養(yǎng)基。Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.4 Western blotWestern blot檢測(cè)腎癌細(xì)胞系中CD151蛋白表達(dá)水平。提取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HK-2、Caki-1、Caki-2和786-0細(xì)胞的總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入SDS上樣緩沖液，煮沸5 min，-20 ℃保存。配置SDS-PAGE膠，每樣本取20 μg蛋白常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜。使用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加一抗4 ℃孵育過夜，次日緩沖液漂洗3次，每次5 min，加二抗室溫孵育2 h后緩沖液漂洗3次，每次5 min。ECL液顯色后曝光拍照，選用β-actin作為內(nèi)參。

Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率和CD151基因沉默對(duì)E-cad、N-cad和Vimentin蛋白表達(dá)的影響。收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，提取總蛋白，以上述同樣方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)遷移實(shí)驗(yàn)：胰酶消化已轉(zhuǎn)染過的Caki-1和Caki-2細(xì)胞，終止消化離心后用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，測(cè)濃度，稀釋至適宜濃度，在24孔板底部加入600 μL含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基，小室內(nèi)加入200 μL含有2×104個(gè)細(xì)胞的無血清細(xì)胞懸液，將小室小心放入24孔板孔內(nèi)，避免氣泡產(chǎn)生，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后，用鑷子小心取出小室，用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)部液體和殘留的細(xì)胞，室溫下用甲醇固定30 min；取出小室，吸干室內(nèi)液體，移入結(jié)晶紫中，室溫下染色30 min；取出小室，PBS中漂洗數(shù)次，吸干水分，顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

侵襲實(shí)驗(yàn)：用50 mg/L Matrigel基質(zhì)膠稀釋液包被滅菌的Transwell小室聚碳酸脂膜上室面，4℃風(fēng)干。在24孔板底部加入600μL含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基，在小室內(nèi)加入200 μL含有5×104個(gè)細(xì)胞的無血清細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。其他步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 腎癌細(xì)胞系中CD151的表達(dá)水平Western blot 結(jié)果表明CD151在Caki-1、Caki-2和786-0細(xì)胞系中的表達(dá)高于HK-2細(xì)胞系(圖1)，說明CD151在腎透明細(xì)胞癌中高表達(dá)。其中，Caki-1細(xì)胞系來源于腎透明細(xì)胞癌皮膚轉(zhuǎn)移，而Caki-2來源于腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞、786-0來源于腎腺癌細(xì)胞，且Caki-2細(xì)胞系中CD151表達(dá)稍高，所以最終選擇Caki-1和Caki-2細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 腎癌細(xì)胞系中CD151表達(dá)水平

β-actin：內(nèi)參；HK-2：人腎小管上皮細(xì)胞；Caki-1：人腎透明細(xì)胞癌皮膚轉(zhuǎn)移細(xì)胞；Caki-2：人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞；786-0：人腎腺癌細(xì)胞。

2.2 Western blot檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率與siCtrl組相比，siCD151組的CD151蛋白表達(dá)量明顯下降。提示CD151-siRNA可以下調(diào)Caki-1和Caki-2細(xì)胞中CD151的表達(dá)(圖2)。熒光轉(zhuǎn)染對(duì)照顯示轉(zhuǎn)染效率(圖3)。

圖2 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CD151表達(dá)水平

2.3 沉默CD151基因?qū)δI透明細(xì)胞癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示，在2種腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系Caki-1和Caki-2中，與siCtrl組相比，siCD151組穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)目分別減少了57%和47%，兩組比較差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示沉默CD151基因后腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移能力減弱(圖3)。

Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)也得到相似結(jié)果，在Caki-1和Caki-2細(xì)胞系中，與siCtrl組相比，siCD151組穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)目分別減少了32%和43%，兩組比較差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示沉默CD151基因后能抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲能力(圖4)。

圖3 熒光轉(zhuǎn)染對(duì)照顯示Caki-1和Caki-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

圖4 CD151基因沉默對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響

A：Caki-1和Caki-2細(xì)胞遷移、侵襲；B：Caki-1細(xì)胞遷移侵襲分析柱狀圖；C：Caki-2細(xì)胞遷移侵襲分析柱狀圖。兩組比較，*P<0.05(n=3)。

2.4 干擾CD151基因?qū)-cad、N-cad和Vimentin蛋白表達(dá)的影響Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與EMT相關(guān)的蛋白變化，結(jié)果顯示，siCD151組Caki-1和Caki-2細(xì)胞中E-cad的蛋白表達(dá)水平比siCtrl組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而N-cad和Vimentin的表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。以上結(jié)果提示CD151基因可能通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程(epithelial-mesenchymal transition,EMT)而促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移侵襲能力。

圖5 轉(zhuǎn)染siCD151后兩種腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞中E-cad、N-cad和Vimentin蛋白的表達(dá)

A：Western blot檢測(cè)；B：E-cad蛋白表達(dá)灰度分析柱狀圖；C：N-cad蛋白表達(dá)灰度分析柱狀圖；D：Vimentin蛋白表達(dá)灰度分析柱狀圖。兩組比較，*P<0.05(n=3)。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)CD151(也稱作GP-27、MER2、PETA-3、SFA-1或者Tspan24)在不同的細(xì)胞類型中都有表達(dá)[11]，并且已被證實(shí)在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌等腫瘤組織中均高表達(dá)[2-7]。有文獻(xiàn)報(bào)道CD151通過介導(dǎo)細(xì)胞粘附相關(guān)信號(hào)通路而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，從而促進(jìn)骨肉瘤的轉(zhuǎn)移[12]。CD151也可以通過與其他四跨膜蛋白家族成員(比如CD9、CD81)或者整合素(integrins)交互作用從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和粘附的作用[13-14]。僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道過CD151可能用來預(yù)測(cè)腎透明細(xì)胞癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移潛能[15-16]。本研究也證實(shí)，CD151在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系中高表達(dá)，干擾CD151基因的表達(dá)后腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力明顯下降。

腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移涉及一系列的細(xì)胞生理改變(比如EMT)，以及增加并激活細(xì)胞外一些蛋白酶(比如MMPs)從而降解細(xì)胞外基質(zhì)等復(fù)雜的過程[17]。EMT，即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程。其主要的特征有上皮表型(比如E-cad)的丟失和間質(zhì)表型(比如N-cad和Vimentin)的獲得[18]。本研究證實(shí)，與對(duì)照組相比，干擾組E-cad的表達(dá)量顯著升高，N-cad和Vimentin的表達(dá)量則顯著降低。因此，我們推測(cè)CD151對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移侵襲能力的影響可能是通過促進(jìn)EMT而實(shí)現(xiàn)的。TGF-β1 被公認(rèn)為通過誘導(dǎo) EMT 而起到腫瘤啟動(dòng)子的作用，我們推測(cè) CD151 可能影響 TGF-β1的表達(dá)，進(jìn)而激活EMT過程，從而促進(jìn)腎癌轉(zhuǎn)移。但是，本研究目前還存在一些局限性，比如轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，還缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證 CD151 在腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用。下一步，我們將持續(xù)關(guān)注國際上的相關(guān)研究進(jìn)展，并開展進(jìn)一步研究，著重探究CD151與TGF-β1/Smad信號(hào)通路以及腎透明細(xì)胞癌之間的關(guān)系。

綜上所述，CD151通過促進(jìn)EMT而增強(qiáng)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力，該基因有可能成為腎透明細(xì)胞癌生物治療的重要靶點(diǎn)。