徐 鑫，姚 堯，王慶國(guó)，劉 佩

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018）

0 引言

馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)全面豐富，是繼水稻、小麥、玉米后中國(guó)第四大糧食作物，被稱為“能源植物”、“地下蘋果”、“第二面包”等[1]。馬鈴薯鮮切產(chǎn)品薯?xiàng)l、薯片、薯塊等越來(lái)越受到人們的喜愛，市場(chǎng)消費(fèi)量較大。但是鮮切馬鈴薯由于切割所造成的機(jī)械傷會(huì)引發(fā)一系列的生理生化變化，如褐變、失水、腐爛、異味等，其中褐變是影響鮮切產(chǎn)品質(zhì)量的主要問(wèn)題[2-3]。

多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)是鮮切馬鈴薯褐變的關(guān)鍵酶，研究表明通過(guò)人工合成小RNA的方法 沉 默 PPO 基 因 (StuPPO1、StuPPO2、StuPPO3、StuPPO4)能有效抑制馬鈴薯的褐變[4]。PPO和過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)能夠氧化植物組織中酚類及氨基酸底物形成鄰醌，醌自身的聚合以及與蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)間的聚合可促進(jìn)組織褐變的加重[5-6]。研究表明，馬鈴薯中游離酪氨酸是PPO 催化的主要底物[7]。然而，目前關(guān)于馬鈴薯其他內(nèi)源性的游離氨基酸變化與酶促褐變之間關(guān)聯(lián)性的研究還較少。Thybo[8]研究表明，游離天冬氨酸含量高的馬鈴薯品種鮮切后易褐變；Ali等[5]對(duì)鮮切馬鈴薯進(jìn)行外源氨基酸涂抹實(shí)驗(yàn)，研究表明高濃度纈氨酸可與醌類形成褐色加合物加重褐變，半胱氨酸則與醌類形成無(wú)色加合物而減輕褐變[9]。

馬鈴薯采收后通常于2～4℃下低溫貯藏，以減輕失水、發(fā)芽和腐爛從而延長(zhǎng)馬鈴薯銷售期。但經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間低溫貯藏的馬鈴薯，在鮮切加工過(guò)程中，表面更易發(fā)生褐變[10]?；販靥幚磉m用于經(jīng)冷庫(kù)低溫貯藏的馬鈴薯，并具有諸多優(yōu)勢(shì)，如安全、高效、能減少低溫貯藏導(dǎo)致的還原糖積累，減輕馬鈴薯在高溫烘焙、油炸過(guò)程中與游離氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生類黑素[11-12]等。前人研究發(fā)現(xiàn)回溫處理對(duì)抑制鮮切蘋果、洋姜和馬鈴薯褐變有較好的效果[13-15]，但褐變機(jī)理的相關(guān)研究并不深入，且馬鈴薯中游離氨基酸的變化與褐變之間的關(guān)聯(lián)并不明確。

筆者針對(duì)低溫貯藏后的馬鈴薯，采用20℃回溫處理20 天，研究在回溫及鮮切后低溫貯藏過(guò)程中，馬鈴薯PPO 和POD 酶活性、游離氨基酸及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的變化，探究回溫處理對(duì)鮮切馬鈴薯褐變控制的生理機(jī)制，旨在為鮮切馬鈴薯的貯藏保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用馬鈴薯品種為‘荷蘭15號(hào)’，于2017年2月購(gòu)于萊蕪市楊莊鎮(zhèn)聚富食品有限公司，已于2℃冷庫(kù)貯藏8個(gè)月，紙箱內(nèi)襯保鮮袋網(wǎng)套包裝，運(yùn)至山東省泰安市山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2～4℃冷庫(kù)。

1.2 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱，濟(jì)南科達(dá)爾實(shí)業(yè)有限公司；紫外分光光度計(jì)T6 新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；2004-21(501)超級(jí)恒溫水浴鍋，國(guó)華儀器有限公司；Beckman Allegra 64R 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；-80℃超低溫冰箱，中科美菱；超聲波振蕩器，上海生析超聲儀器有限公司；微型冷庫(kù)，濟(jì)南科達(dá)爾實(shí)業(yè)有限公司；CR-400 色差計(jì)，日本柯尼卡美能達(dá)儀器有限公司；液氮研磨儀，德國(guó)IKA 公司；高效液相色譜儀，日本島津LC-20AT；C18液相色譜柱，日本島津。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備 挑選180個(gè)大小一致、形狀均勻、無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)發(fā)芽、無(wú)綠變、無(wú)病蟲害的馬鈴薯，將氯苯胺靈（質(zhì)量濃度為30 mg/kg）溶于乙醇，與1 kg 細(xì)沙混勻后均勻地撒施于馬鈴薯表面，用于抑制馬鈴薯發(fā)芽。將馬鈴薯每10 個(gè)裝入一個(gè)聚乙烯袋（尺寸為240 mm×350 mm）中，均分為2 組（每組9 袋馬鈴薯），一組為對(duì)照，于2～4℃冷庫(kù)20 天；一組為回溫處理組，于20℃恒溫箱中處理20天；

每組9 袋馬鈴薯，其中6 袋用于回溫處理前后取樣，3袋馬鈴薯用于鮮切后觀測(cè)及取樣。

回溫前、回溫后2個(gè)取樣點(diǎn)進(jìn)行取樣，每個(gè)取樣點(diǎn)3個(gè)重復(fù)，取樣后用液氮速凍，置于超低溫冰箱(-80℃)中備用，樣品用于PPO活性、POD活性、游離氨基酸和MDA含量的測(cè)定。

鮮切過(guò)程如下：將馬鈴薯用清水洗凈，紗布擦干后，次氯酸鈉溶液(200 μL/L)中消毒5 min；去皮，切成3～5 mm的薄片，放入50 μL/L的次氯酸鈉溶液中消毒約15 s后用紗布吸干表面水分。將馬鈴薯切片隨機(jī)混勻，分別裝入13 個(gè)聚乙烯袋中（尺寸為175 mm×250 mm），每袋10 片馬鈴薯，袋口折疊，于2～4℃冷庫(kù)中貯藏。

鮮切后觀測(cè)及取樣過(guò)程如下：對(duì)照和處理各7袋，在切后0、1、2、4、6、8、12 天分別進(jìn)行拍照和色差測(cè)定。其余6袋在切后0、0.5、1、2、4、6天取樣，每個(gè)取樣點(diǎn)3個(gè)重復(fù)，用液氮冷凍并放入-80℃超低溫冰箱，分別用于PPO活性、POD活性、游離氨基酸和MDA含量的測(cè)定。

1.3.2 褐變度等級(jí)評(píng)定與標(biāo)準(zhǔn)制定 將不同褐變程度的馬鈴薯片進(jìn)行比較，制定了馬鈴薯褐變程度的等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。1=無(wú)褐變；2=輕微褐變（面積≤5%）；3=中度褐變（5%＜面積≤20%）；4=褐變較嚴(yán)重（20%＜面積≤50%）；5=褐變嚴(yán)重（面積＞50%）。

1.3.3 色差測(cè)定 對(duì)不同褐變程度的馬鈴薯片進(jìn)行色差測(cè)定。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取8片，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。使用柯尼卡美能達(dá)公司的CR-400 色差計(jì)測(cè)定馬鈴薯切片粗糙面的顏色值(L*、a*)，每次測(cè)定前以標(biāo)準(zhǔn)白度(L*=97.06，a*=0.04)對(duì)色差計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.3.4 PPO 活性測(cè)定 粗酶液的提取及PPO 酶活性測(cè)定參考Baltacio?lu等[16]的方法并加以改進(jìn)。依次向試管中加入2 mL pH 6.8 的磷酸緩沖液、20 mmol/L 鄰苯二酚溶液1 mL、粗酶液0.4 mL，混勻后，立即測(cè)定在420 nm 下的吸光值每30 s 的變化，測(cè)定連續(xù)6 組數(shù)據(jù)。以1 g 馬鈴薯樣品（鮮重）每分鐘吸光度值變化0.01為1個(gè)酶活性單位(U)。

1.3.5 POD 活性測(cè)定 采用愈創(chuàng)木酚比色法[17]測(cè)定POD酶活性。以1 g馬鈴薯樣品（鮮重）每分鐘內(nèi)吸光度變化為1 個(gè)酶活性單位(U)。POD 活性的測(cè)定波長(zhǎng)為470 nm。

1.3.6 游離氨基酸含量測(cè)定 馬鈴薯游離氨基酸的提取參考Kumar 等[18]的方法，分別配制16 種游離氨基酸（酪氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸）標(biāo)準(zhǔn)樣品(0.1 mg/mL)。游離氨基酸樣品的分析采用日本島津LC-20AT 高效液相色譜，色譜柱型號(hào)為Inertsil ODS-3 5020-01731，方法參照輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4356—2012[19]。

1.3.7 MDA含量測(cè)定 稱取1 g馬鈴薯樣品，加入4 mL 10%三氯乙酸，勻漿后4℃、10000 r/min 離心15 min 得到上清待測(cè)液。MDA 含量參照硫代巴比妥酸煮沸法測(cè)定[20]。

圖1 鮮切馬鈴薯褐變等級(jí)

表1 褐變等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)色差值

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，不同處理方法間的數(shù)據(jù)使用SPSS 17 軟件的鄧肯法進(jìn)行顯著性差異分析，顯著性水平為0.05，使用Excel 2010軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮切馬鈴薯褐變等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的制定

馬鈴薯經(jīng)低溫貯藏后，鮮切加工過(guò)程易發(fā)生褐變，在開發(fā)馬鈴薯褐變抑制方法的過(guò)程中，為了更好地對(duì)馬鈴薯褐變進(jìn)行觀察記錄，首先制定了鮮切馬鈴薯褐變等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，并測(cè)定了相應(yīng)的馬鈴薯片表面的L*和a*值，如圖1、表1所示，后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中鮮切馬鈴薯的褐變均嚴(yán)格參照此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定。

2.2 回溫處理對(duì)鮮切馬鈴薯褐變程度及L*、a*值的影響

低溫貯藏后的馬鈴薯塊莖于20℃回溫20天，鮮切后低溫貯藏期間，進(jìn)行觀察并拍照（圖2）。由圖2 可知，對(duì)照2天即出現(xiàn)較嚴(yán)重褐變，而回溫處理的馬鈴薯鮮切后8天仍具有較好的色澤，未發(fā)生褐變，貨架期延長(zhǎng)了6天。

分別在鮮切0、1、2、4、6、8、12 天進(jìn)行了色差L*、a*值測(cè)定。如圖3所示，鮮切后低溫貯藏期間，對(duì)照組馬鈴薯片2 天內(nèi)L*值快速下降，而經(jīng)回溫處理后的馬鈴薯鮮切片L*值8 天內(nèi)均下降緩慢，并一直維持在70 以上，顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)；由圖3B可知，與對(duì)照相比，回溫處理顯著降低了馬鈴薯片a*值的上升(P＜0.05)。

由圖2～3 可知，回溫處理顯著提高了鮮切馬鈴薯L*值，降低了a*值，顯著抑制了表面褐變的發(fā)生，有利于保持鮮切馬鈴薯表面原有的色澤和亮度，延長(zhǎng)貨架期。

2.3 回溫處理對(duì)馬鈴薯PPO酶和POD酶活性的影響

在有氧條件下，PPO 可催化內(nèi)源性酚類底物生成醌，醌類物質(zhì)聚合產(chǎn)生黑色素，是引起馬鈴薯褐變的主要因素[21-22]；POD 亦是參與酚氧化的主要酶類之一[6]。分別測(cè)定了馬鈴薯回溫過(guò)程中以及鮮切后的PPO 和POD 酶活。如圖4A 所示，與對(duì)照相比，回溫前后PPO酶活性變化并不顯著；但鮮切后低溫貯藏期間，經(jīng)回溫處理的馬鈴薯片PPO 酶活性均一直顯著低于對(duì)照(P＜0.05)。由圖4B 可見，與對(duì)照相比，回溫前后POD酶活性并無(wú)顯著變化；但鮮切后，經(jīng)回溫處理的馬鈴薯片POD活性始終低于對(duì)照(P＜0.05)。

2.4 回溫處理對(duì)馬鈴薯游離氨基酸含量的影響

在馬鈴薯中，游離酪氨酸是PPO催化的主要酚類底物[7]，酪氨酸的氧化往往造成鮮切馬鈴薯表面紅褐色以至黑色褐變的形成。而不同氨基酸對(duì)馬鈴薯鮮切褐變的影響并不相同[5]，為了探究馬鈴薯中內(nèi)源性游離氨基酸與酶促褐變的關(guān)系，用高效液相色譜法測(cè)定了鮮切馬鈴薯中16種游離氨基酸的含量，并對(duì)總游離氨基酸含量及發(fā)生顯著變化的7種游離氨基酸進(jìn)行了分析。

圖2 回溫處理對(duì)鮮切馬鈴薯褐變的影響

圖3 回溫處理對(duì)鮮切馬鈴薯L*和a*值的影響

圖4 回溫處理對(duì)馬鈴薯PPO酶和POD酶活性的影響

對(duì)照在低溫貯藏20天過(guò)程中，總游離氨基酸含量呈下降趨勢(shì)，如圖5 所示，而經(jīng)回溫處理的馬鈴薯，回溫后總游離氨基酸的含量降低更為顯著；因此，經(jīng)回溫后的馬鈴薯，鮮切時(shí)初始游離總氨基酸的含量顯著低于對(duì)照組。

如圖6A～E所示，經(jīng)回溫處理的馬鈴薯，鮮切初始的（即鮮切0 天）游離酪氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、丙氨酸的含量均顯著低于對(duì)照組。在鮮切后貯藏期間，回溫處理組馬鈴薯游離酪氨酸含量，除第4 天，均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；游離絲氨酸含量一直顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；鮮切后2天內(nèi)，游離天冬氨酸含量顯著低于對(duì)照(P＜0.05)；鮮切后3天內(nèi)，游離丙氨酸含量顯著低于對(duì)照(P＜0.05)。如圖6F 所示，回溫后，處理組與對(duì)照組馬鈴薯游離甘氨酸含量并無(wú)顯著差異；但從鮮切后12 h到4天間，回溫處理提高了馬鈴薯游離甘氨酸的含量。其余8 種游離氨基酸，包括游離蘇氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等，在回溫后以及鮮切過(guò)程中與對(duì)照相比均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。游離半胱氨酸在處理組和對(duì)照組馬鈴薯中均未檢出。

圖5 回溫處理對(duì)馬鈴薯總游離氨基酸含量的影響

2.5 回溫處理對(duì)馬鈴薯游離脯氨酸和MDA含量的影響

在對(duì)單一游離氨基酸進(jìn)行分析的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)回溫處理的馬鈴薯回溫后及鮮切過(guò)程中，游離脯氨酸含量呈上升趨勢(shì)，且顯著高于對(duì)照(P＜0.05)，如圖7A。植物脯氨酸含量的增加往往會(huì)影響植物抗氧化能力[23]。對(duì)馬鈴薯MDA 含量測(cè)定如圖7B 所示，結(jié)果表明對(duì)照馬鈴薯鮮切后，短時(shí)間內(nèi)MDA 含量快速上升，但經(jīng)回溫處理的馬鈴薯鮮切后，MDA 含量增速緩慢，并在整個(gè)鮮切后貯藏期間，始終顯著低于對(duì)照組。

3 結(jié)論

回溫處理能有效抑制鮮切馬鈴薯褐變，顯著降低PPO和POD酶活性，降低鮮切初始游離總氨基酸的含量，主要包括游離酪氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、丙氨酸等；增加了鮮切過(guò)程中游離甘氨酸含量；游離脯氨酸的含量在回溫和鮮切后均顯著上升；此外，回溫顯著降低了鮮切后馬鈴薯MDA含量。因此回溫處理通過(guò)降低PPO和POD酶活性，減少了褐變底物游離酪氨酸及其他游離氨基酸（包括游離纈氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、丙氨酸）含量，提高了游離甘氨酸的含量，增強(qiáng)了游離脯氨酸以及降低MDA 含量，從而更好地保護(hù)細(xì)胞膜完整性，抑制了低溫貯藏后馬鈴薯的鮮切褐變。

圖6 回溫處理對(duì)馬鈴薯6種游離氨基酸含量的影響

圖7 回溫處理對(duì)馬鈴薯游離脯氨酸和MDA含量的影響

4 討論

4.1 回溫處理可以有效地抑制鮮切馬鈴薯表面褐變

低溫貯藏的馬鈴薯鮮切后表面易發(fā)生褐變，且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)褐變加重[10]。張兵兵等[15]的研究結(jié)果表明，對(duì)‘荷蘭15 號(hào)’馬鈴薯進(jìn)行不同溫度的回溫，均能有效抑制鮮切馬鈴薯表面的褐變。本研究中，對(duì)低溫貯藏8個(gè)月的‘荷蘭15號(hào)’馬鈴薯進(jìn)行20℃回溫處理20天后鮮切，回溫處理顯著提高了鮮切馬鈴薯片L*值、降低了a*值，鮮切后8天仍具有較好的色澤。針對(duì)于低溫貯藏馬鈴薯，在鮮切加工過(guò)程褐變顯著的問(wèn)題，回溫處理可以有效地減緩鮮切后馬鈴薯的褐變，更好地延長(zhǎng)貨架期。然而曹裕[24]的研究表明，低溫貯藏大于10個(gè)月的‘荷蘭7號(hào)’馬鈴薯，經(jīng)回溫處理并沒(méi)有顯著抑制鮮切馬鈴薯表面的褐變。也進(jìn)一步說(shuō)明，20℃條件下長(zhǎng)時(shí)間的回溫處理，往往需要在使用前進(jìn)行抑芽劑處理，且低溫貯藏期過(guò)長(zhǎng)，貯藏過(guò)程中發(fā)生霉變、發(fā)芽、失水、萎蔫等較嚴(yán)重的馬鈴薯并不適宜。

4.2 回溫處理有效地抑制鮮切馬鈴薯PPO、POD酶活性并降低部分游離氨基酸的積累

PPO 氧化組織中內(nèi)源性底物形成鄰醌，鄰醌再相互聚合或與蛋白質(zhì)、氨基酸等作用生成高分子絡(luò)合物而使組織發(fā)生褐變[5]，而回溫處理降低了鮮切馬鈴薯PPO酶活性，顯著地抑制了褐變的發(fā)生；回溫處理還可以抑制切后馬鈴薯POD活性，可能是因?yàn)榛販靥幚頊p少了機(jī)械傷產(chǎn)生的自由基尤其是活性氧的產(chǎn)生和積累，從而減輕了體內(nèi)自由基對(duì)POD酶的催化作用[25]。

游離酪氨酸作為主要酚類底物，往往會(huì)在PPO催化下直接參與馬鈴薯鮮切褐變[7]；Thybo[8]研究發(fā)現(xiàn)，天冬氨酸含量高的馬鈴薯品種鮮切后更易褐變；Ali等[5]用外源氨基酸處理鮮切馬鈴薯，研究結(jié)果表明1 mol/L纈氨酸溶液加重褐變而10 mmol/L的甘氨酸溶液能輕微地減輕褐變。然而馬鈴薯中諸多游離氨基酸與褐變的關(guān)系并不明確。本研究中，回溫處理減少了鮮切后馬鈴薯褐變底物游離酪氨酸的積累，游離天冬氨酸含量顯著降低，并在鮮切后貯藏2天前顯著低于對(duì)照；游離纈氨酸的含量在回溫后及切后貯藏期間，均顯著低于對(duì)照，說(shuō)明回溫處理減少了馬鈴薯中內(nèi)源性的游離纈氨酸的含量，進(jìn)而有效減少了與醌類結(jié)合生成褐色物質(zhì)；游離甘氨酸含量回溫后中無(wú)顯著變化，但在鮮切貯藏前期，游離甘氨酸的含量顯著高于對(duì)照(P＜0.05)。另有游離絲氨酸在回溫后及切后貯藏期間，均顯著低于對(duì)照(P＜0.05)；游離丙氨酸在鮮切貯藏前期顯著低于對(duì)照組。通過(guò)研究回溫對(duì)游離氨基酸代謝的影響，初步探討了游離氨基酸與鮮切馬鈴薯褐變之間的關(guān)聯(lián)。后期筆者可針對(duì)回溫處理過(guò)程中變化顯著的氨基酸，應(yīng)用外源氨基酸處理鮮切馬鈴薯，探討其對(duì)鮮切馬鈴薯褐變的影響；另一方面可從馬鈴薯內(nèi)源游離氨基酸的代謝通路著手，分析回溫對(duì)氨基酸代謝通路影響的分子機(jī)制。

4.3 回溫處理可以有效地增加脯氨酸、抑制MDA的積累

脯氨酸積累可以提高植物抗性，有效清除細(xì)胞損傷產(chǎn)生的活性氧，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力[23]。蘇貝貝等[26]研究表明，外源脯氨酸處理可以提高半夏的抗氧能力，提高細(xì)胞對(duì)活性氧的清除能力。Toivonen 等[13]研究表明經(jīng)過(guò)回溫處理的蘋果可以減少鮮切后細(xì)胞膜的損傷。研究表明，回溫處理顯著提高了馬鈴薯中滲透物質(zhì)游離脯氨酸的積累，有利于增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，提高馬鈴薯抵御脅迫、機(jī)械傷害的能力?；販靥幚砗螅彼岷康奶岣?，MDA含量的降低，使得馬鈴薯在鮮切或遭遇機(jī)械傷害的時(shí)候，更有利于維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，減少鮮切造成的細(xì)胞膜損傷，有效地抑制褐變的發(fā)生。后期通過(guò)分析并研究回溫對(duì)脯氨酸合成、降解基因表達(dá)的影響，對(duì)抗氧化體系防護(hù)酶基因表達(dá)及活性的影響，對(duì)細(xì)胞膜穩(wěn)定相關(guān)蛋白基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討回溫抑制鮮切馬鈴薯褐變的分子機(jī)制。