王曉敏 趙如月 周 凡

新疆華世丹藥物研究有限責(zé)任公司，新疆 烏魯木齊 830011

復(fù)方巴旦仁顆粒由巴旦仁、蜀葵子、睡蓮花、甘草浸膏等六味藥材組成，是維吾爾名醫(yī)經(jīng)驗方，在臨床上主要用于寒性感冒、咳嗽痰多、氣喘、咽喉腫痛、鼻塞流涕、支氣管炎干咳、哮喘等癥的治療。維吾爾醫(yī)認為復(fù)方巴旦仁顆粒具有生濕生熱，祛除風(fēng)寒，調(diào)節(jié)異常氣質(zhì)，止咳化痰，溫肺止喘的功效[1]。該處方中含有的甘草浸膏，既是我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥的重要組成，也是維吾爾醫(yī)藥中的常用藥味，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、調(diào)和諸藥等作用[2]。目前關(guān)于甘草及其提取物的化學(xué)成分和藥理作用研究相對比較充分，現(xiàn)代藥理學(xué)表明，甘草和甘草提取物在呼吸系統(tǒng)方面具有止咳、化痰、定喘以及抗呼吸道感染等作用，特別是甘草中的黃酮類成分以及甘草酸、甘草次酸在呼吸系統(tǒng)方面作用顯著[3-4]。復(fù)方巴旦仁顆粒為在研的中藥復(fù)方制劑，為有效控制其質(zhì)量，本研究在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立過程中選擇甘草酸作為質(zhì)量控制指標(biāo)之一，建立復(fù)方巴旦仁顆粒中甘草酸的含量測定方法。

1 儀器與試藥

儀器：島津LC-20AD高效液相色譜儀，F(xiàn)A1004分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)，CPA225D分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

試藥：甘草酸銨對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110731-201619，含量93.0%)，復(fù)方巴旦仁顆粒(新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號1902160101、1902160201、1902160301；新疆華世丹藥物研究有限責(zé)任公司自制，批號20180202)，乙腈、冰乙酸均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent TC-C18(4.6×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-1%冰乙酸溶液(39∶61)；檢測波長：250 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按甘草酸峰計算應(yīng)不低于5000。

2.2 溶液配制

2.2.1 甘草酸銨對照品溶液 精密稱取甘草酸銨對照品26.77 mg，用50%乙腈溶解并定容至50 mL容量瓶中，搖勻，即得甘草酸銨對照品儲備液。精密量取上述溶液2 mL至10 mL容量瓶中，用50%乙腈稀釋并定容至刻度，搖勻，即得甘草酸銨對照品溶液(每1 mL含甘草酸銨約0.1 mg，折合甘草酸約為0.098 mg)。

2.2.2 復(fù)方巴旦仁顆粒供試品溶液 取本品約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入流動相50 mL，超聲處理20 min，取出，放冷，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性對照顆粒供試品溶液 按處方比例稱取除甘草浸膏以外的其他藥味，按照復(fù)方巴旦仁顆粒的生產(chǎn)工藝制成陰性對照顆粒，再按2.2.2項下的方法制成缺甘草浸膏的陰性對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性 精密吸取供試品溶液、陰性對照溶液、甘草酸銨對照品溶液各10μL進樣分析，記錄色譜圖(見圖1)。結(jié)果陰性對照溶液在甘草酸銨色譜峰相應(yīng)位置上無干擾，可在此條件下進行樣品中甘草酸的含量測定。

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取甘草酸銨對照品儲備液0.4 mL、1.0 mL、1.6 mL、2.0 mL、2.4 mL、3.0 mL、4.0 mL至10 mL容量瓶中，用50%乙腈稀釋并定容至刻度，搖勻，即得線性系列溶液。取上述對照品溶液各10 μL，注入色譜儀分析測定，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進行線性回歸。得回歸方程Y=8873.9X-25182(R2=0.9996，n=7)，見圖2。即甘草酸銨濃度范圍在19.92～199.17 μg/mL時，線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度 精密吸取甘草酸銨對照品溶液10 μL，重復(fù)進樣6次，結(jié)果甘草酸銨峰面積的RSD=0.05%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 加樣回收率試驗 取已知含量的復(fù)方巴旦仁顆粒(批號20180202)適量，加入低、中、高(50%、100%、150%)系列濃度的對照品，按擬定的色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果平均回收率102.49%(n=9，RSD=2.05%)，見表1，表明方法回收率較好。

2.3.5 重復(fù)性 分別稱取同一批號復(fù)方巴旦仁顆粒(20180202)5份，按照2.2.2項下的方法制備成供試品溶液，進樣測定。結(jié)果樣品中甘草酸的平均含量為1.257%，RSD=1.49%，表明方法重復(fù)性較好。

2.3.6 溶液穩(wěn)定性 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，結(jié)果甘草酸銨峰面積的RSD=0.08%，表明復(fù)方巴旦仁顆粒供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 樣品測定 分別稱取3批(1902160101、1902160201、1902160301)復(fù)方巴旦仁顆粒樣品，按照2.2.2項下的方法制成供試品溶液，并按2.1項下的色譜條件進行測定，計算含量。結(jié)果見表2。從該測定結(jié)果可以看出中試車間連續(xù)生產(chǎn)的3批樣品質(zhì)量穩(wěn)定，批間差異不大。

3 討論

3.1 流動相的選擇 本實驗曾用《中國藥典》2015版中甘草浸膏和甘草流浸膏的方法進行試測，結(jié)果均不理想，因此查閱相關(guān)資料進行了流動相調(diào)整[5-9]。實驗先后考察了乙腈-磷酸體系、乙腈-冰乙酸體系和甲醇-冰乙酸體系，發(fā)現(xiàn)乙腈-冰乙酸體系可以獲得較好的峰形且分析時柱壓更低，在保留時間相當(dāng)時分離效果更好。通過調(diào)整有機相-水相比例和酸濃度，最終發(fā)現(xiàn)流動相為乙腈-1%冰乙酸溶液(39∶61)時，所得峰形對稱性好，樣品主峰和雜質(zhì)峰可以有效分離，理論塔板數(shù)較高。

表1 樣品的回收率測定

表2 三批樣品含量測定結(jié)果

3.2 檢測波長的選擇 取甘草酸銨對照品溶液，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘草酸銨在250.6 nm處有最大吸收，最終選擇250 nm作為液相色譜含量測定的檢測波長。

3.3 耐用性 實驗表明，當(dāng)流速變化為(1.0±0.1)mL/min、檢測波長變化為(250±5)nm時，對含量測定的結(jié)果幾乎沒有影響。柱溫的改變會影響甘草酸銨主峰與周圍雜質(zhì)峰的分離，經(jīng)測試，柱溫40 ℃下能達到較好的分離效果。

3.4 提取條件 本實驗考察了不同超聲時間制得的樣品含量，結(jié)果顯示超聲提取20 min即可提取完全；還考察了使用不同提取溶劑配制的樣品含量，結(jié)果用流動相提取時效率高且雜質(zhì)干擾少。

甘草酸為甘草浸膏中的主要成分，止咳祛痰作用明確，也是復(fù)方巴旦仁顆粒中的重要藥效成分。采用本法測定復(fù)方巴旦仁顆粒中的甘草酸含量，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于控制復(fù)方巴旦仁顆粒的質(zhì)量。同時，現(xiàn)代分析技術(shù)與傳統(tǒng)民族藥的結(jié)合有利于推進民族藥的產(chǎn)業(yè)化和規(guī)范化，該方法的建立對完善民族藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了一定參考。