黃文思，葉麗君，宋明哲，朱元昌，孫青，李觀貴，曾勇*

(1.深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，深圳 518045；2.深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045；3.深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳 518045)

目前，臨床上常用常規(guī)精液分析的參數(shù)(包括精子濃度、總數(shù)、活動力與形態(tài)學等)來評估男性生育力。但是部分男性不育是由精子DNA損傷引起的[1]，常規(guī)精液分析參數(shù)異常的不育男性的精子DNA損傷通常增多，也有部分常規(guī)精液參數(shù)正常的不育男性的精子DNA損傷也較多，而常規(guī)精液分析不包括精子DNA損傷的檢測[1]，因此常規(guī)精液分析的參數(shù)對臨床診斷男性不育及男性生育力評估的價值存在局限性。近年來，DNA碎片指數(shù)(DFI)作為評估精子DNA損傷的重要指標被廣泛研究，并且越來越多的研究指出DFI比常規(guī)精液分析參數(shù)對男性不育診斷和生育力評估有更好的價值[2-4]。有報道指出，精子DNA損傷與自然受孕、宮腔內(nèi)人工授精(IUI)[5]和IVF低的妊娠率有關[6-7]，并與IVF/ICSI妊娠丟失的高風險存在相關性[6-8]。但是，也有報道指出DFI與輔助生殖技術(ART)妊娠結局無相關性[9-10]。可見DFI與ART治療結局的相關性仍然存在爭議。本文旨在分析DFI與IVF/ICSI治療結局的關系，探討精子DNA損傷對IVF/ICSI結局的影響。

材料與方法

一、研究對象

回顧性分析2017年1～12月因不孕不育前來深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心就診的夫婦，男方在男科實驗室同期進行精液常規(guī)檢查和DFI檢測，這些夫婦后續(xù)根據(jù)ART治療指征選擇IVF或ICSI治療。IVF治療的指征為男方精液檢查未見異常，因女方因素不育的夫婦。ICSI治療的指征為男方精子濃度<2×106/ml；或者精子濃度2×106/ml～20×106/ml，活動精子百分率<40%或前向運動精子<25%；或者精子濃度≥20×106/ml，活動精子百分率<5%；或者正常形態(tài)前向運動精子總數(shù)≤1×106/ml的不育夫婦。

入選標準：夫婦雙方無性傳播疾病史、無遺傳性疾?。粊碓褐委煹牡谝恢芷?，并為新鮮胚胎移植周期。

排除標準：男方排除精子濃度<2×106/ml、無精子癥等因素(因DFI檢測對于精子數(shù)量的需求)；女方排除輸卵管積水、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤等因素。

共有311對夫婦符合上述標準，其中134對夫婦行常規(guī)IVF治療，177對夫婦行ICSI治療。

二、方法

1.精液參數(shù)分析：取卵日前3個月內(nèi)，參照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版(WHO5th)的標準采集和處理精液標本。利用電子天平(深圳衡之寶)稱量精液質量，計算精液體積。采用Makler計數(shù)池(Sefi-Makler，以色列)載樣放于相差顯微鏡(尼康，日本)，通過計算機輔助精液分析操作系統(tǒng)(CASA系統(tǒng)，Microptic，西班牙)計算精子濃度、各級精子百分率和活動精子百分率，前向運動精子為主動地呈直線或沿一大圓周運動的精子，非前向運動精子為所有其他非前向運動的精子。使用Diff-Quik染色液(深圳華康生物)進行精子染色，在光學顯微鏡下人工分析精子形態(tài)學。精液常規(guī)參數(shù)的正常范圍分別為：體積≥1.5 ml，精子濃度≥15×106/ml，前向運動精子百分率≥32%，活動精子百分率≥40%，正常形態(tài)精子百分率≥4%。

2.精子染色質結構分析法(SCSA)法測定DFI值：運用基于流式細胞術的SCSA法測定DFI值，使用精子核完整性染色試劑盒(浙江星博生物)進行檢測，按照試劑盒說明書方法操作。經(jīng)吖啶橙染色后上流式細胞儀(BD Accuri C6，美國)檢測熒光，計算DFI(%)=綠色熒光精子數(shù)/(綠色熒光精子數(shù)+紅色熒光精子數(shù))×100%。根據(jù)DFI參考值將IVF和ICSI周期的患者分別分為DFI≤30%組和DFI>30%組[11-13]。

3.精液處理：男方禁欲2～7 d，在取卵日通過手淫法取精，精液在室溫下液化后，采用密度梯度離心法處理精液，再置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

4.控制性促排卵和卵母細胞收集：本中心采用標準方案、常規(guī)長方案、短方案和超長方案促排卵。當優(yōu)勢卵泡直徑≥18 mm時，注射HCG，34～36 h后行陰道B超穿刺取卵，卵細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

5.治療方式：(1)IVF治療：卵母細胞培養(yǎng)3～5 h后授精，每個卵母細胞加入5～10萬個精子。受精后16～18 h去除卵丘細胞，觀察受精情況，出現(xiàn)2個原核為正常受精。觀察受精后胚胎的卵裂及發(fā)育情況。(2)ICSI治療：取卵后4～6 h進行卵胞漿內(nèi)單精子注射。受精72 h后，根據(jù)本中心實際情況制定的胚胎評分系統(tǒng)將胚胎分級，然后選擇1～2個優(yōu)質胚胎移植。

6.觀察指標、妊娠結局判斷：MⅡ卵率=(MⅡ卵母細胞數(shù)目/獲卵總數(shù)目)×100%；MⅡ卵受精率=(受精卵數(shù)目/MⅡ卵母細胞數(shù)目)×100%；卵裂率=(受精卵裂數(shù)目/受精卵數(shù)目)×100%；優(yōu)胚率=(優(yōu)質胚胎數(shù)目/受精卵裂數(shù)目)×100%；臨床妊娠率=(臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù))×100%；流產(chǎn)率=(流產(chǎn)例數(shù)/臨床妊娠例數(shù))×100%。胚胎移植14 d后驗血HCG，呈陽性為生化妊娠。移植5周后B超檢查見子宮腔內(nèi)有妊娠囊及原始搏動，即確定為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標準差)表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，采用皮爾遜相關性分析方法分析相關性；呈非正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)[表示方式為中位數(shù)(四分位距)]，則采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗進行分析，采用斯皮爾曼相關性分析方法分析相關性。計數(shù)數(shù)據(jù)組間比較采用皮爾遜χ2檢驗分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、研究對象的基本情況

本研究共分析134個IVF鮮胚移植周期，其中DFI≤30%組100個周期、DFI>30%組34個周期，和177個ICSI鮮胚移植周期，其中DFI≤30%組100個周期、DFI>30%組77個周期。IVF周期與ICSI周期中，DFI≤30%組的DFI、男方年齡均顯著低于DFI>30%組(P<0.05)，而組間不育年限、女方年齡、女方BMI、獲卵數(shù)均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

二、DFI與精液參數(shù)的相關性

在IVF與ICSI周期，男方DFI>30%組的前向運動精子百分率和活動精子百分率均顯著低于DFI≤30%組(P<0.05)，而組間的精液體積差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。另外，在ICSI周期，DFI>30%組的精子濃度、前向運動精子百分率均顯著低于DFI≤30%組(P<0.05)；但在IVF周期，DFI>30%組與DFI≤30%組間的其他精液參數(shù)(包括精子濃度、非前向運動精子百分率與正常形態(tài)精子百分率)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

在IVF與ICSI周期，DFI與前向運動精子百分率、活動精子百分率均呈中度負相關。在ICSI周期，DFI還與精子濃度、非前向運動精子百分率、正常形態(tài)精子百分率呈極弱負相關(表3)。

表1 不同DFI組的患者基本情況及各項觀察指標的比較 (-±s)

注：與DFI≤30%組比較，*P<0.05

表2 不同DFI水平的各項精液參數(shù)的比較 [中位數(shù)(四分位距)]

注：與DFI≤30%組比較，*P<0.05，#P<0.001

表3 DFI與各精液參數(shù)的相關性分析

注：|r|<0.3，極弱相關；0.3<|r|<0.5，低度相關；0.5<|r|<0.8，中度相關；|r|>0.8，高度相關。與DFI的相關性分析，*P<0.05，#P<0.001

三、DFI與IVF/ICSI治療結局的關系

在IVF周期，DFI>30%組的受精率、卵裂率均顯著低于DFI≤30%組(P<0.05)，但兩組的優(yōu)胚率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在ICSI周期，DFI>30%組的優(yōu)胚率顯著低于DFI≤30% 組(P<0.05)，而兩組的胚胎發(fā)育情況包括受精率、卵裂率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。另外，無論行IVF治療還是行ICSI治療，不同DFI水平的臨床妊娠率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；DFI>30%組的流產(chǎn)率高于DFI≤30%組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表4)。

在IVF周期，DFI與受精率、卵裂率均呈極弱負相關(P<0.05)。但是，在ICSI周期，DFI與受精率、卵裂率、優(yōu)胚率均沒有相關性(P>0.05)(表5)。

表4 不同DFI水平的IVF和ICSI結局各項觀察指標的比較(%)

注：與DFI≤30%組比較，*P<0.05；a：早期流產(chǎn)；b：晚期流產(chǎn)；a+b：早期流產(chǎn)和晚期流產(chǎn)

表5 DFI與IVF和ICSI治療結局各指標的相關性分析

注：|r|<0.3，極弱相關；0.3<|r|<0.5，低度相關；0.5<|r|<0.8，中度相關；|r|>0.8，高度相關。與DFI的相關性分析，*P<0.05

討論

近年越來越多研究關注精子DNA損傷，一方面是由于特發(fā)性不育男性中精子DNA斷裂發(fā)生率高；另一方面是由于DNA斷裂的精子被用于輔助生殖受精可能帶來潛在的不良結局。

本研究顯示DFI>30%組的男方年齡顯著高于DFI≤30%組，但精子DFI與年齡相關性較弱。Vagnini等[14]的研究結果也表明隨著年齡的增加精子DFI有所增加，但臨床意義有限。Singh等[15]對此現(xiàn)象的解釋是隨著年齡的增長，清除凋亡精子的機制減退，不能有效清除DNA受損的精子，可能是DFI升高的原因之一。隨著年齡的增加，男性生殖功能逐漸減退，Belloc等[16]研究發(fā)現(xiàn)男方年齡也是影響臨床妊娠率的重要因素，臨床妊娠率隨男方年齡的增加而下降，從<35歲時的14.4%下降至>45歲時的9.3%(P<0.01)。本研究組發(fā)現(xiàn)男方年齡與IVF周期的受精率、卵裂率、臨床妊娠率呈極低到低度的負相關(r分別為-0.371、-0.377和-0.227，P<0.05)，與ICSI周期的優(yōu)胚率呈低度負相關(r=-0.321，P<0.05)(數(shù)據(jù)未顯示)。這提示男方年齡可能影響IVF/ICSI的治療結局，在一定程度上對DFI與IVF/ICSI的治療結局相關性分析造成影響。

精子DNA損傷與精液質量相關[1，4，17]；而有的報道則指出精子DNA損傷與精液參數(shù)無相關性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，無論IVF周期還是ICSI周期，DFI>30%組的前向運動精子百分率均顯著低于DFI≤30%組，且DFI與前向運動精子百分率呈中度負相關。另外，在ICSI周期DFI>30%組的精子濃度、非前向運動精子百分率與正常形態(tài)精子百分率均顯著低于DFI≤30%組，且DFI與這些精液參數(shù)呈極弱到低度的負相關。這說明精子DNA損傷與精液質量存在相關性，尤其是前向運動精子百分率。劉作強等[19]發(fā)現(xiàn)IVF的受精率、優(yōu)胚率與精液常規(guī)參數(shù)無相關性，但優(yōu)胚率與DFI呈負相關，建議臨床中應重視精子功能檢查，以獲得更好的治療結局。本研究組也發(fā)現(xiàn)精液參數(shù)包括精子濃度、前向運動精子百分率、活動精子百分率和正常形態(tài)精子百分率等與IVF的受精率、卵裂率以及ICSI的優(yōu)胚率無相關性(P>0.05)(數(shù)據(jù)未顯示)，然而DFI與IVF的受精率、卵裂率均呈極弱負相關(P<0.05)。結果表明，DFI可作為評估精子功能的一項指標，也是精液常規(guī)分析參數(shù)的有效補充，對其的檢查有益于臨床評估男性生育力。

不少研究報道精子DNA損傷對胚胎發(fā)育和臨床妊娠情況的影響，有研究指出精子DNA損傷在IVF與ICSI周期對優(yōu)胚率和臨床妊娠率存在負面影響[6，13，20]。國內(nèi)的一篇Meta分析也顯示，在IVF周期，高DFI降低IVF的受精率、優(yōu)胚率和臨床妊娠率，增加IVF和ICSI的流產(chǎn)率，但對ICSI的受精率、優(yōu)胚率和臨床妊娠率無影響[21]，建議高DFI患者選擇ICSI治療[21-22]。有學者則認為DFI與IVF和ICSI結局沒有相關性，Sun等[12]研究了238個IVF周期和152個ICSI周期，在IVF或ICSI周期DFI>30%組與DFI≤30%組的受精率、優(yōu)胚率和臨床妊娠率的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提出DFI不能預測行ART治療患者的受精率、胚胎質量和臨床妊娠率。存在這些爭議可能原因有：一是研究對象的入選標準不同，二是DFI檢測方法不同，三是卵母細胞對精子DNA損傷的修復能力不同等。

本研究比較IVF鮮胚移植的臨床結局發(fā)現(xiàn)，DFI>30%組IVF周期的受精率與卵裂率較DFI≤30%組降低，DFI與受精率、卵裂率均呈極弱的負相關，而不同DFI組的臨床妊娠率和流產(chǎn)率的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這提示DFI可能影響早期胚胎發(fā)育，對IVF周期的臨床結局無明顯影響。比較ICSI鮮胚移植的臨床結局發(fā)現(xiàn)，DFI>30%組的優(yōu)胚率較DFI≤30%組降低，這提示精子DNA損傷對胚胎的前期發(fā)育有負面影響。但是，DFI的增多沒有降低ICSI的臨床妊娠率，雖然ICSI的流產(chǎn)率增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。由此可見，DFI在一定程度上可以預測IVF和ICSI的胚胎前期發(fā)育，但對IVF和ICSI臨床結局的預測價值有限，這可能與卵母細胞可以修復精子DNA損傷[23]有關。這可能提示在IVF周期中，精子DNA損傷可能導致受精率和卵裂率降低[24-26]；而ICSI治療能“繞過”精子DNA損傷給精子和卵母細胞受精時帶來的影響[27]，但無法準確地篩選到DNA完整的精子進行注射，因此DFI>30%組的優(yōu)質胚胎率有可能降低；隨著后續(xù)卵母細胞對精子DNA損傷的修復作用，使胚胎發(fā)育正常，不同DFI組間臨床結局的差異縮小。

綜上所述， DFI檢測可作為常規(guī)精液分析的補充。另外，精子DNA損傷可能影響ART的早期胚胎發(fā)育，降低IVF周期的受精率與卵裂率，和ICSI周期的優(yōu)胚率，提示精子DFI檢測對預測ART的早期胚胎發(fā)育有一定參考價值，但對ART的臨床妊娠結局的預測價值有限。