馬志，趙慧珊，張妍，劉曉妍，郝翠芳*

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部，青島 266071；2.青島大學(xué)附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，煙臺(tái) 264000；3.中科院動(dòng)物研究所，北京 100101)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女最常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病，具有較大異質(zhì)性。根據(jù)不同的診斷標(biāo)準(zhǔn)和人群統(tǒng)計(jì)，其發(fā)病率介于6%～8%(NIH標(biāo)準(zhǔn))至20%(鹿特丹標(biāo)準(zhǔn))之間[1-2]。在無(wú)排卵性不孕患者中，約有75%被診斷為PCOS[3]。罹患PCOS的女性會(huì)出現(xiàn)全身多個(gè)系統(tǒng)的短期和長(zhǎng)期并發(fā)癥，包括生殖(多毛、閉經(jīng)、無(wú)排卵、不孕和妊娠合并癥)、代謝(2型糖尿病、心血管系統(tǒng)疾病和脂質(zhì)代謝異常)和精神(消極、焦慮)等方面[4]。目前針對(duì)PCOS的治療也多為對(duì)癥處理，尚無(wú)法完全治愈。

環(huán)狀RNA(Circular RNA，circRNA)現(xiàn)多認(rèn)為是非編碼RNA的一種，因其呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，缺少5’帽端和3’ poly A尾而得名。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，circRNA普遍存在于多種真核生物中，可抵御RNA酶R的降解，表達(dá)呈現(xiàn)出組織和時(shí)序特異性[5]。研究發(fā)現(xiàn)circRNA通過(guò)“吸附”microRNA(miRNA)、調(diào)節(jié)可變剪接和親本基因表達(dá)，廣泛參與到各類疾病的發(fā)生發(fā)展，包括腫瘤、子癇前期，心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[6-9]等方面，但在PCOS中尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)芯片檢測(cè)及后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證PCOS患者卵丘顆粒細(xì)胞中特異性circRNA的表達(dá)，并對(duì)circRNA表達(dá)水平和患者臨床特征資料進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為進(jìn)一步探索PCOS發(fā)病機(jī)制和診療方法提供了新的思路。

資料與方法

一、研究對(duì)象

1.患者來(lái)源：收集2017年5～12月期間于青島大學(xué)附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行IVF/ICSI-ET助孕的典型PCOS患者6例，同時(shí)選取同時(shí)期因男方或者輸卵管因素治療的6例患者為對(duì)照組。收集卵丘顆粒細(xì)胞，送circRNA芯片檢測(cè)；芯片結(jié)果回報(bào)后，另選取同時(shí)期的PCOS及卵巢正常對(duì)照各25例患者，收集卵丘顆粒細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。

入組標(biāo)準(zhǔn)：PCOS組患者均嚴(yán)格按照鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)[10]篩選：稀發(fā)排卵或無(wú)排卵、卵巢多囊樣改變、高雄激素表現(xiàn)或高雄激素血癥，滿足其中兩條及以上，且排除先天性腎上腺皮質(zhì)增生、庫(kù)欣綜合征和雄激素分泌性腫瘤等導(dǎo)致雄激素異常升高的疾病；正常對(duì)照組患者均因男方或輸卵管因素而尋求助孕治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：子宮內(nèi)膜異位癥、甲狀腺或內(nèi)分泌功能異常及全身系統(tǒng)性疾病等情況。所有患者均為第一周期、標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案促排卵。

2.主要試劑及儀器：Trizol reagent(Takara，日本)、QuantiTect Reverse Transcription Kit(QIAGEN，德國(guó))、QuantiNova SYBR Green PCR Kit(QIAGEN，德國(guó))、qRT-PCR引物由上海生工生物公司合成；NanoDrop 2000分光光度計(jì)(ThermoFisher Scientific，美國(guó))、StepOnePlus 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國(guó))、Human CircRNA Array v2芯片檢測(cè)平臺(tái)(北京博奧)。

二、研究方法

1.資料收集：分別收集PCOS(n=25)及正常對(duì)照組患者(n=25)臨床特征資料進(jìn)行回顧分析。收集內(nèi)容包括：年齡，體重指數(shù)(BMI)，抗苗勒氏管激素(AMH)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、LH/FSH、雌二醇(E2)、睪酮(T)、孕酮(P)、催乳素(PRL)、抑制素B(INHB)和25-(OH)D3水平，以及促排卵過(guò)程中的Gn總用量、獲卵數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)和優(yōu)胚率。

2.卵丘顆粒細(xì)胞的收集：HCG扳機(jī)后36 h，按照取卵標(biāo)準(zhǔn)穿刺取卵，獲得卵母細(xì)胞-放射冠-卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合體(COC)，用1 ml注射器針頭仔細(xì)機(jī)械剝離得到卵丘顆粒細(xì)胞，PBS清洗3遍后，凍存于-80℃待提取RNA。

3.總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄：依照Takara Trizol regent說(shuō)明書(shū)，采用一步法抽提顆粒細(xì)胞總RNA。取1 μl RNA溶液，NanoDrop 2000測(cè)定濃度及A260/A280判斷純度。取1 μg總RNA于20 μl體系中，根據(jù)QuantiTect Reverse Transcription Kit說(shuō)明書(shū)步驟逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

4.CircRNA芯片檢測(cè)：由北京博奧公司Human CircRNA Array v2芯片平臺(tái)完成，包含可檢測(cè)170 340種人circRNA的探針。circRNA靶序列來(lái)自Circbase、Deepbase和Rybak-Wolf2015[11]等數(shù)據(jù)庫(kù)。

5.qRT-PCR：circRNA具有特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其與同源的mRNA的差異僅在成環(huán)的接頭處，因此所有引物均針對(duì)接頭處序列進(jìn)行擴(kuò)增。由NCBI的Primer-BLAST設(shè)計(jì)完成，內(nèi)參基因選定β-actin，引物序列見(jiàn)表1。將逆轉(zhuǎn)合成的cDNA稀釋5倍作為模板，按照QuantiNova SYBR Green PCR Kit說(shuō)明書(shū)操作，具體反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性2 min，然后按照95℃ 5 s，60℃ 10 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；記錄各組Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算circRNA相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本至少3次重復(fù)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

表1 熒光定量PCR引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、患者的一般資料及臨床特征

1.circRNA芯片送檢樣本來(lái)源患者：PCOS組患者BMI、AMH、LH、LH/FSH、T均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；PCOS組獲卵數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；Gn總用量低于對(duì)照組，優(yōu)胚數(shù)稍高于對(duì)照組，但均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；兩組間其他參數(shù)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

2.進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證患者：PCOS組患者的BMI、AMH、LH、LH/FSH、T和P均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，F(xiàn)SH顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)；促排卵過(guò)程中PCOS組獲卵數(shù)顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，Gn總用量低于對(duì)照組、優(yōu)胚數(shù)稍高于對(duì)照組，但均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；兩組間年齡、優(yōu)胚率、E2、PRL、INHB和25-(OH)D3差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

二、circRNA芯片表達(dá)譜

從芯片數(shù)據(jù)聚類圖和散點(diǎn)圖(圖1)可以看出，進(jìn)行芯片檢測(cè)的6例PCOS與正常對(duì)照患者樣本卵丘顆粒細(xì)胞circRNA的表達(dá)存在顯著差異。在286個(gè)篩選的差異表達(dá)circRNA中，PCOS組上調(diào)表達(dá)167個(gè)，下調(diào)表達(dá)119個(gè)。為進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們按差異倍數(shù)(Fold Change，F(xiàn)C)>4，P<0.01挑選出3個(gè)待測(cè)circRNA(表4)，在擴(kuò)大樣本(PCOS與正常對(duì)照各25例)中進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。

表2 circRNA芯片樣本來(lái)源患者的基本臨床資料(-±s)

注：本中心優(yōu)質(zhì)胚胎指受精第3天，細(xì)胞數(shù)在6～9，分級(jí)為1或2級(jí)的胚胎；優(yōu)胚率=第3天優(yōu)胚數(shù)/2PN胚胎數(shù)；與PCOS組比較，*P<0.05；T、P、PRL換算為法定單位分別為(ng/dl×0.034)nmol/L、(ng/ml×3.17)nmol/L、(ng/ml×0.0455)nmol/L

表3 qRT-PCR驗(yàn)證的兩組患者一般資料與臨床特征(-±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；T、P、PRL換算為法定單位分別為(ng/dl×0.034)nmol/L、(ng/ml×3.17)nmol/L、(ng/ml×0.0455)nmol/L

A：聚類圖；B：散點(diǎn)圖；紅色和綠色分別表示在PCOS組中顯著上調(diào)和下調(diào)的基因；P和N分別代表PCOS組和對(duì)照組樣本

表4 待測(cè)circRNA基本信息

三、待測(cè)circRNA在兩組患者卵丘顆粒細(xì)胞中的表達(dá)情況

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，PCOS組中hsa_circ_0043533表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，hsa_circ_0097636顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，qRT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果相一致；而hsa_circ_0020491表達(dá)在兩組間無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖2)。

四、circRNA表達(dá)與PCOS臨床特征值的相關(guān)性分析

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，PCOS組hsa_circ_0043533(r=0.399 9，P=0.047 6)和hsa_circ_0097636(r=0.507 5，P=0.009 6)的相對(duì)表達(dá)量與T水平均呈正相關(guān)；正常對(duì)照組中hsa_circ_0097636的相對(duì)表達(dá)量與E2水平有正相關(guān)性(r=0.608 8，P=0.005 7)(表5)。

圖2 3個(gè)驗(yàn)證circRNA在PCOS和正常對(duì)照組患者中的表達(dá)

表5 Spearman秩相關(guān)分析患者臨床特征值與差異表達(dá)circRNA之間的相關(guān)性

注：*P<0.05

五、circRNA對(duì)于PCOS的診斷效力

hsa_circ_0043533和hsa_circ_0097636作為診斷指標(biāo)時(shí)，ROC曲線的AUC分別為0.709(95%CI：0.566-0.851)、0.738(95%CI：0.599-0.877)。hsa_circ_0097636聯(lián)合T作為診斷指標(biāo)，可得出Logistic回歸方程：Logit(P)=-0.206 3+(-2.539× hsa_circ_0097636)+(13.254×T)，AUC為0.893(95%CI：0.807-0.978)，敏感度0.68，特異性為1(圖3)。

圖3 不同差異表達(dá)的circRNA診斷PCOS的ROC曲線

討論

PCOS的病因至今尚未完全明確，臨床表現(xiàn)也存在高度異質(zhì)性，以卵泡發(fā)育障礙和激素合成異常，尤其是雄激素合成亢進(jìn)為顯著特征?，F(xiàn)廣泛認(rèn)為PCOS是多重遺傳與環(huán)境因素共同作用下導(dǎo)致的復(fù)雜病癥[12]。迄今為止，已有包括MAPK-ERK、Wnt/β-catenin和PI3K-Akt pathways[12-14]等在內(nèi)的多條信號(hào)通路在PCOS發(fā)病機(jī)制中被提出，這些信號(hào)通路包含miRNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)等眾多非編碼RNA分子的參與，為更好地靶向治療PCOS提供了思路。

CircRNA最早于20世紀(jì)70年代在高等植物中被首次發(fā)現(xiàn)，但受限于當(dāng)時(shí)的研究手段，其曾一度被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄過(guò)程的副產(chǎn)物或由錯(cuò)誤剪接所形成。直到近十年，隨著高通量測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，人們才認(rèn)識(shí)到circRNA是廣泛穩(wěn)定存在的，且具有相當(dāng)重要的調(diào)節(jié)功能[15]。目前，circRNA在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮的多種作用被提出并加以研究[16]，其最為主要的功能是作為miRNA“海綿”：小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物(antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript，CDR1as)是circRNA的一種，研究表明其在腦組織中可吸附63個(gè)miR-7；在研究斑馬魚(yú)中腦的發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)CDR1as會(huì)引起miR-7表達(dá)下降而導(dǎo)致中腦發(fā)育受損[17]。在大多數(shù)研究中，circRNA會(huì)下調(diào)其靶向miRNA的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)miRNA下游靶向mRNA的表達(dá)以調(diào)控基因功能網(wǎng)絡(luò)。例如，在糖尿病患者視網(wǎng)膜組織中上調(diào)circHIPK3會(huì)通過(guò)“吸附機(jī)制”阻斷miR-30a-3p的功能而上調(diào)下游VEGF-C、FZD4和WNT2的表達(dá)，并最終導(dǎo)致內(nèi)皮增生和血管功能障礙[18]。但近來(lái)也有研究指出與前者截然相反的發(fā)現(xiàn)：利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除小鼠基因組中的CDR1as位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦組織中miR-7表達(dá)異常、穩(wěn)定性下降，而miR-7下游靶基因Fos和Nr4a3表達(dá)顯著升高，出現(xiàn)感知運(yùn)動(dòng)功能和神經(jīng)精神系統(tǒng)障礙[19]。這些研究表明，circRNA在競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(Competing endogenous RNAs，ceRNAs)網(wǎng)絡(luò)中的作用遠(yuǎn)比想象的要復(fù)雜，還需要更加深入的探索。

相對(duì)于circRNA，miRNA在PCOS中的研究則要廣泛、成熟許多。如今已有大量具有重要功能的miRNA在PCOS患者外周血、卵泡液和顆粒細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)：miR-93在PCOS患者脂肪細(xì)胞中顯著高表達(dá)，可通過(guò)靶向結(jié)合葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(Glucose transporter isoform 4，GLUT-4)的3′UTR區(qū)下調(diào)GLUT-4的表達(dá)而導(dǎo)致胰島素抵抗癥狀的出現(xiàn)[20]；miR-320a在PCOS患者卵丘顆粒細(xì)胞中顯著低表達(dá)，可引起編碼激素合成關(guān)鍵酶的基因Cyp17a1和Cyp19a1的調(diào)節(jié)障礙，而出現(xiàn)顆粒細(xì)胞的雌激素合成缺陷[21]。

鑒于眾多學(xué)者對(duì)于circRNA作為“miRNA海綿”這一特殊功能的報(bào)道，本研究通過(guò)芯片平臺(tái)檢測(cè)及后續(xù)qRT-PCR的挑選驗(yàn)證，首次揭示了PCOS患者卵丘顆粒細(xì)胞中特異性circRNA的表達(dá)。證實(shí)hsa_circ_0043533和hsa_circ_0097636在PCOS患者卵丘顆粒細(xì)胞中分別顯著上調(diào)和下調(diào)。相關(guān)性分析提示，二者的表達(dá)與患者睪酮水平呈現(xiàn)正相關(guān)性。眾所周知，高雄激素血癥是PCOS誘發(fā)因素和顯著特征之一，但有研究指出雄激素受體敲除的小鼠會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的生殖缺陷，這也提示了雄激素在平衡卵泡發(fā)育與卵泡閉鎖之間的重要作用[22]。本研究中，我們通過(guò)miRanda (34.236.212.39/microrna/home.do)和Targetscan (www.targetscan.org/vert_71/)對(duì)circRNA和miRNA的相互作用進(jìn)行了預(yù)測(cè)。在眾多預(yù)測(cè)結(jié)合的miRNA中，我們發(fā)現(xiàn)miR-125b和miR-30c有hsa_circ_0097636結(jié)合位點(diǎn)，miR-132有hsa_circ_0043533結(jié)合位點(diǎn)，而這3種miRNA在之前關(guān)于PCOS的研究中均有報(bào)道[22-24]。miR-125b為抗凋亡miRNA的一種，在卵巢組織中表達(dá)豐富[25]，過(guò)高的雄激素可促進(jìn)miR-125b的表達(dá)，進(jìn)而避免卵泡的凋亡和閉鎖[22]，這或許能部分解釋伴有高雄激血癥的PCOS患者易出現(xiàn)過(guò)多卵泡發(fā)育。已有報(bào)道m(xù)iR-30c在PCOS患者血清中高表達(dá)[23]，我們推測(cè)上調(diào)表達(dá)的miR-125b和miR-30c可能是由于hsa_circ_0097636顯著低表達(dá)，導(dǎo)致“吸附”減少所致。另有一項(xiàng)基因組水平的篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-132可抑制體外培養(yǎng)的人卵巢細(xì)胞三種甾體激素(P、E2和T)的合成[24]，我們猜測(cè)hsa_circ_0043533可能通過(guò)“吸附” miR-132來(lái)影響PCOS患者卵巢局部的激素合成?？偟膩?lái)說(shuō)，本研究驗(yàn)證的兩種在卵丘顆粒細(xì)胞中異常表達(dá)的circRNA可能通過(guò)特定的circRNA-miRNA相互作用而影響到PCOS患者的卵泡發(fā)育和激素合成。

本研究通過(guò)繪制ROC曲線評(píng)價(jià)了不同差異表達(dá)的circRNA對(duì)于PCOS的診斷效能，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合hsa_circ_0097636與T可使診斷效能顯著提高。由于circRNA可抵抗RNA酶R的降解，具有足夠高的穩(wěn)定性，其有望在未來(lái)作為診斷或篩選PCOS的一個(gè)良好生物學(xué)分子指標(biāo)。

綜上所述，PCOS患者卵丘顆粒細(xì)胞中circRNA hsa_circ_0097636和hsa_circ_0043533的表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比存在顯著差異。本研究證實(shí)了兩種差異表達(dá)的circRNA與T水平的相關(guān)性，初步驗(yàn)證了聯(lián)合hsa_circ_0097636與T診斷PCOS的可能性。驗(yàn)證出的兩種circRNA可能通過(guò)circRNA-miRNA的相互作用參與卵泡發(fā)育和激素合成的調(diào)控過(guò)程繼而影響到PCOS的發(fā)生發(fā)展，但此推論尚需更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究為深入理解PCOS發(fā)病機(jī)制和探索診治方法提供了更為廣闊的思路。