李楊，汪翰英，吳大鵬，盧曉云，韓樹堂

肝癌(Liver cancer)是惡性度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，其防治形勢十分嚴峻[1-2]。對多數(shù)患者來說，明確診斷時已失去手術根治的機會，放療、化療也不能取得較好的治療效果，尋找新型藥物十分重要[3]。中藥能影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移等各個環(huán)節(jié)，為腫瘤的治療帶來了新的策略[4]。中藥重樓(Polyphylla)，是百合科植物重樓的根莖，用于中藥方劑中抗腫瘤治療已有多年歷史[5-8]。重樓皂苷Ⅰ(Polyphylla saponins I， PS I)是重樓中含量最大的一種甾體皂苷，其制備和鑒定方法相對完善[9]。研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷Ⅰ可通過內(nèi)質網(wǎng)應激途徑抑制肝癌細胞增殖，誘導細胞凋亡[10]，但其具體下游機制尚不明確。

TRB3(Tribbles related protein 3)即果蠅相關蛋白3，為內(nèi)質網(wǎng)應激下游相關蛋白之一。TRB3與腫瘤的關系十分密切。有多項研究表明，TRB3在多種腫瘤組織和腫瘤細胞系中表達呈現(xiàn)出差異，并且與腫瘤的預后相關。本研究的前期研究也表明，TRB3通過抑制Akt磷酸化，誘導細胞凋亡[11]。本研究將在前期研究基礎上，通過TRB3基因的調控來探討重樓皂苷Ⅰ抗肝細胞癌作用及其機制，為重樓皂苷Ⅰ抗肝細胞癌作用提供基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞系及培養(yǎng)

人肝癌細胞系HepG2及MHCC-97H細胞為本科室保存，細胞培養(yǎng)于DMEM (GE Healthcare Life Sciences, 美國)+10% 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Thermo Fisher Scientific, Inc., 美國)培養(yǎng)基中，保存于5% CO2的 37 ℃溫箱內(nèi)。

1.2 CCK8(Cell Counting Kit-8)法測定細胞增殖

取含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，10∶1加入CCK-8試劑，配成工作液，加入細胞中，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，測定在450 nm處的光密度(optical density，OD)值，并進行分析。CCK8試劑盒購自日本同仁化學研究所。

1.3 Western Blot

裂解細胞，提取總蛋白；BCA試劑盒(Thermo Fisher Scientific, Inc., 美國)測定蛋白濃度；蛋白變性后進行電泳、轉膜、封閉、孵育一抗和二抗；顯影，條帶顯影后使用Photoshop6.0(Adobe，美國)進行灰度測定?？贵w：Rabbit anti-TRB3(Abclonal，美國)；Rabbit anti-GAPDH(Abclonal，美國)；辣根過氧化物酶(HRP)標記兔二抗(Santa Cruz，美國)。

1.4 RT-qPCR

從網(wǎng)絡(GeneBank，https://cipotato.org/genebankcip/)獲取TRB3的完整序列，使用Primer premier5.0軟件(Primer, Inc., 加拿大)設計PCR引物，交由上海生工生物技術服務公司合成。PCR引物如下：GAPDH-F: CATGAGAAGTATG-ACAACAGCCT，GAPDH-R:AGTCCTTCCACGATACCAAAGT；TRB3-F: GCTGCCAACAGTGGATTGA，TRB3-R: GCTTCTGCC-TTTCTCCCTTCT。取對數(shù)生長期細胞，Trizol?(Thermo Fisher Scientific, Inc, 美國)提取總RNA，按逆轉錄試劑盒(Takara, 日本)說明操作，逆轉錄為cDNA。按PCR試劑盒(Takara, Japan)說明書配制反應體系，使用FTC3000(Funglyn，加拿大)進行Real-time qPCR，程序如下：1)95 ℃ 30 s；2)95 ℃ 5s+60 ℃ 1 min，重復40次；3)60 ℃ 5 min，使用2-ΔΔCt法比較各組間的差異。

1.5 shRNA構建及轉染

從網(wǎng)絡(GeneBank，https://cipotato.org/genebankcip/)獲取TRB3的完整序列，根據(jù)Tuschl原則各設計shRNA，分別干擾TRB3 mRNA，獲取shRNA-TRB3序列(TRB3-S：CCGGG-CCAACAGTGGATTGAGTTTGCTCGAGCAAACTCAATCCACTG-TTGGCTTTTTG；TRB3-A：AATTCAAAAAGCCAACAGTGGAT-TGAGTTTGCTCGAGCAAACTCAATCCACTGTTGGC)，交于上海吉瑪公司合成并制作商品化慢病毒(使用pSUPER質粒)，通過轉染HepG2和MHCC-97H細胞建立穩(wěn)轉細胞株，經(jīng)過前期篩選和驗證[11]，選取穩(wěn)定且轉染良好的細胞進行實驗，轉染試劑盒購自日本Takara公司。

1.6 實驗分組

1.6.1 重樓皂苷Ⅰ抑制肝癌細胞增殖 重樓皂苷Ⅰ(成都德斯特生物技術有限公司，中國)加入DMEM +10% FBS，別配制成1、2、4、8、16、32 μmol/L藥液備用，取對數(shù)生長期肝癌細胞HepG2和MHCC-97H，分別加入1、2、4、8、16、32 μmol/L重樓皂苷Ⅰ 10 μL及等量空白對照組(0 μmol/L)，每孔分別另外設2復孔，5% CO2的 37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)12 小時，采用CCK8法測定細胞增殖。以同樣方法測定24 h、48 h的0、1、2、4、8、16、32 μmol/L重樓皂苷Ⅰ對肝癌細胞的增殖活性。

1.6.2 重樓皂苷Ⅰ對肝癌細胞TRB3表達的影響 分別取對數(shù)生長期肝癌細胞HepG2和MHCC-97H，分為兩組，重樓皂苷Ⅰ組(PS I組)加入4 μmol/L的重樓皂苷組加入10 μL，空白對照組(NC組)中加入等量DMEM +10% FBS培養(yǎng)基，5% CO2的 37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，進行Western Blot和RT-qPCR，測定TRB3蛋白和mRNA表達。

1.6.3 重樓皂苷Ⅰ對TRB3低表達肝癌細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期肝癌細胞HepG2和shRNA-TRB3穩(wěn)轉HepG2細胞，分為四組，每組3孔，分別為： ①空白對照組(NC組)：HepG2細胞加入DMEM +10% FBS培養(yǎng)基10 μL；②重樓皂苷Ⅰ組(PS I組)：HepG2細胞加入4 μmol/L重樓皂苷Ⅰ 10 μL；③shRNA-TRB3穩(wěn)轉組(shRNA組)：shRNA-TRB3穩(wěn)轉HepG2細胞加入DMEM +10% FBS培養(yǎng)基10 μL，④shRNA-TRB3穩(wěn)轉重樓皂苷Ⅰ組(shRNA+PS I組)：shRNA-TRB3穩(wěn)轉HepG2細胞加入4 μmol/L重樓皂苷Ⅰ 10 μL。將4組細胞放置在5% CO237 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，CCK8測定細胞增殖情況。對MHCC-97H細胞進行同樣分組操作。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件(IBM Inc., 美國)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差的形式表示，多組數(shù)據(jù)分析采用方差分析，比較多組間兩兩差異采用Dunnett檢驗，兩組之間的比較采用獨立樣本的t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義；使用Graphpad Prism 5.0軟件(Graphpad Software, Inc., 美國)進行圖形繪制。

2 結果

2.1 重樓皂苷Ⅰ抑制肝癌細胞增殖

CCK8法檢測重樓皂苷Ⅰ在不同濃度和不同作用時間對肝癌細胞HepG2和MHCC-97H的增殖情況，結果表明，與未經(jīng)重樓皂苷Ⅰ作用的HepG2和MHCC-97H相比，重樓皂苷Ⅰ濃度1、2、4、8、16、32 μmol/L作用12 h、24 h、48 h均能夠抑制肝癌細胞HepG2(表1)和MHCC-97H的增殖(P<0.01)(表2)，這種抑制作用隨著作用時間和藥物濃度的增加而增強，即呈現(xiàn)濃度和時間依賴(圖1)。當重樓皂苷Ⅰ的藥物濃度>8 μmol/L時，這種濃度依賴作用減弱；當重樓皂苷Ⅰ濃度>16 μmol/L時，抑制作用的時間依賴減弱。重樓皂苷Ⅰ對肝癌細胞HepG2的12 h、24 h、48 h的IC50為4.83(95%CI: 2.569～6.443)、2.89(95%CI: 1.90～4.05)、2.065(95%CI: 1.63～2.51)，對肝癌細胞MHCC-97H的12 h、24 h、48 h的IC50為4.33(95%CI: 2.571～6.975)、2.86(95%CI: 2.36～3.40)、2.15(95%CI: 1.72～2.59)。后續(xù)實驗選擇濃度為4 μmol/L的重樓皂苷Ⅰ，作用時間為12 h。

表1 重樓皂苷Ⅰ抑制肝癌細胞HepG2增殖

注：#同時間點與0 μmol/L比較有差異

表2 重樓皂苷Ⅰ抑制肝癌細胞MHCC-97H增殖

注：#同時間點與0 μmol/L比較有差異

圖1重樓皂苷Ⅰ抑制肝癌細胞增殖 A重樓皂苷Ⅰ抑制HepG2細胞增殖；B重樓皂苷Ⅰ抑制MHCC-97H細胞增殖(PS I:重樓皂苷Ⅰ)

2.2 重樓皂苷Ⅰ對肝癌細胞中TRB3表達的影響

Western Blot結果顯示，NC組肝癌細胞HepG2和MHCC-97H中的TRB3表達增強(相對GAPDH，P<0.05)，在重樓皂苷Ⅰ的作用下，HepG2和MHCC-97H細胞中的TRB3表達較空白對照組(NC組)顯著增強(圖2A)。通過灰度值分析，較NC組，重樓皂苷Ⅰ作用后，HepG2和MHCC-97H細胞中的TRB3表達分別升高了9.94倍和29.66倍(P<0.01)(圖2B)。RT-qPCR結果顯示，肝癌細胞HepG2和MHCC-97H細胞中的TRB3 mRNA表達較HGAPDH均增強，在重樓皂苷Ⅰ的作用下，HepG2和MHCC-97H細胞中的TRB3表達較空白對照組(NC組)顯著增強(P<0.05)，分別為11.8倍和8.85倍(圖2C)。

2.3 重樓皂苷Ⅰ對TRB3低表達肝癌細胞增殖的影響

CCK8檢測結果顯示，與空白對照組相比，重樓皂苷Ⅰ組和shRNA-TRB3組的細胞增殖能力減弱；與shRNA組比較，重樓皂苷Ⅰ+shRNA-TRB3 組肝癌細胞HepG2 及MHCC-97H的存活力均顯著增高(P<0. 05)(圖3)，表明TRB3表達下調可減弱重樓皂苷Ⅰ對HepG2及MHCC-97H 細胞的增殖抑制作用，即重樓皂苷Ⅰ可通過TRB3抑制肝癌細胞增殖。

3 討論

重樓皂苷Ⅰ具有體外和體內(nèi)抗腫瘤作用，對包括肺癌[12]、卵巢癌[13]、前列腺癌[14]、膀胱癌[15]及多種消化系統(tǒng)腫瘤細胞系均具有抑制作用。2009年，顏璐璐等[16]的研究表明重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅱ為重樓中最主要的抗腫瘤成分，促進腫瘤細胞凋亡效果最為顯著。重樓皂苷Ⅰ對小鼠肺腺癌細胞株LA795，人肺癌細胞株A549，人宮頸癌細胞株Hela，人結腸癌細胞株CaCo-2，人急性髓性白血病細胞株HL-60，人腎腺癌細胞株A498，人表皮癌細胞株A431，人肝癌細胞株HepG2，BEL7402等均有不同程度的抑制作用，且作用強度遞減。Yu[7]等人認為重樓皂苷Ⅰ具有體內(nèi)抗喉癌作用，并且研究了重樓皂苷Ⅰ的代謝物及其在大鼠中的藥代動力學。他們共檢測出7種代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)氧化、去糖基化和葡糖醛酸化是在大鼠中的主要代謝過程。重樓皂苷Ⅰ的三種去糖基化代謝產(chǎn)物：薯蕷次皂苷A(prosapogenin A)，延齡草皂苷(trillin)和薯蕷皂苷元(diosgenin)均具有明確的抗癌作用。

圖2重樓皂苷Ⅰ對肝癌細胞中TRB3表達的影響 A&B 重樓皂苷Ⅰ增加肝癌細胞HepG2、MHCC-97H中TRB3蛋白表達；C重樓皂苷Ⅰ增加肝癌細胞HepG2、MHCC-97H中TRB3 mRNA表達。(NC：空白對照組，PS I：加入4 μmol/L的重樓皂苷組，*與NC組相比P<0.05)

圖3重樓皂苷Ⅰ對TRB3低表達肝癌細胞增殖的影響 A TRB3低表達，重樓皂苷Ⅰ對HepG2增殖抑制減弱；B TRB3低表達，重樓皂苷Ⅰ對MHCC-97H增殖抑制減弱。(NC：空白對照組PS I: 加入4 μmol/L的重樓皂苷組；shRNA：shRNA-TRB3穩(wěn)轉細胞組；shRNA+PS I：shRNA-TRB3穩(wěn)轉細胞加入4 μmol/L的重樓皂苷組，#與NC組相比P<0.05，*于shRNA組相比P<0.05)

重樓皂苷Ⅰ促進腫瘤細胞凋亡是其抗腫瘤作用的最主要機制之一?，F(xiàn)有研究表明，重樓皂苷Ⅰ可通過線粒體途徑[12]、內(nèi)質網(wǎng)應激途徑[10]、死亡受體途徑[17]等誘導腫瘤細胞凋亡。內(nèi)質網(wǎng)應激途徑是近年來重樓皂苷Ⅰ抗腫瘤作用的研究熱點。當細胞外界環(huán)境發(fā)生改變時，可啟動內(nèi)質網(wǎng)應激(ERS)，減少錯誤蛋白合成、活化蛋白酶體降解胞內(nèi)異常蛋白，恢復ERS導致的損害。當外界刺激過于強烈或持久不能解除時，ERS可啟動細胞程序性死亡[18]。研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷Ⅰ以時間-濃度依賴的方式抑制腫瘤細胞的增殖; 細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)[19]。進一步研究發(fā)現(xiàn)， 重樓皂苷Ⅰ可上調內(nèi)質網(wǎng)應激通路的肌醇依賴酶1(IRE-1)， 下調磷酸化氨基末端激酶1(P-JNK1)和X盒結合蛋白1(XBP1)蛋白質水平，活化內(nèi)質網(wǎng)應激的標志蛋白質Caspase-12， 但未改變C/EBP同源蛋白(CHOP)表達水平[10]。

已發(fā)表的研究表明，TRB3在肝癌細胞MHCC-97H中表達升高3.8倍，TRB3為CHOP下游基因，可以抑制AKT磷酸化，誘導細胞凋亡，同時，ERS發(fā)生時，CHOP可同向調控TRB3[11]。本研究從重樓皂苷Ⅰ對TRB3的調節(jié)為切入點，闡明了重樓皂苷Ⅰ可以使肝癌細胞中TRB3的表達大幅度增加。進一步的研究表明，當TRB3表達降低時，重樓皂苷Ⅰ抑制肝癌細胞增殖的能力減弱。因此，重樓皂苷Ⅰ能通過TRB3這一靶點，增加肝癌細胞中TRB3的表達，抑制AKT磷酸化，進而啟動下游抗增殖相關通路，抑制肝癌細胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用[11, 20]。本研究中，重樓皂苷Ⅰ可使肝癌細胞中TRB3表達增高超過30倍，而在合適的培養(yǎng)狀態(tài)下，肝癌細胞中TRB3表達增加僅僅數(shù)倍，提示TRB3低倍升高時可能對肝癌細胞具有保護作用，而當其高倍數(shù)升高時則對肝癌細胞具有抑制作用，其具體內(nèi)容和潛在機制還需進一步探討?？傊?，重樓皂苷Ⅰ能夠抑制肝癌細胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用，其機制是大幅度增加了TRB3的表達。