王 垚，金前躍，周 穩(wěn)，李旭鋒，柴永笑，丁培陽，陳 曉，邢云瑞，李艷華，郭軍慶，張改平1, ,4

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002； 3.江蘇高校動物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；4.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100)

豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的急性傳染病，臨床表現(xiàn)通常為瘙癢、發(fā)熱、神經(jīng)癥狀等[1]。豬是PRV的唯一自然宿主，但該病毒也可以感染其他多種哺乳動物，包括反芻動物、食肉動物和嚙齒動物。PRV感染豬群后，豬齡越小其臨床癥狀越嚴重[2]，可引起新生仔豬神經(jīng)系統(tǒng)紊亂和死亡、懷孕母豬流產(chǎn)和死胎、育肥豬呼吸困難，對全世界的生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重危害。自2012年我國豬場大規(guī)模感染突變的PRV以來，PRV流行株毒力增強，PR的感染率不斷上升[3]。而且近期有報道PR疑似為人獸共患病，引起了科學(xué)家的高度重視[4]。

PRV屬于皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科、水痘皰疹病毒屬[5]。PRV是雙鏈DNA并具有囊膜的病毒粒子，直徑為180 nm，病毒粒子表面具有長8～10 nm的放射狀纖突，其基因組長為143 kb[6]。PRV含有11個N-或O-鏈糖基化修飾的膜蛋白，分別為gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN蛋白[7]。gB、gC、gD、gH蛋白為病毒主要的保護性抗原，可以刺激動物宿主產(chǎn)生中和抗體。其中，gB基因在病毒入侵細胞和細胞間的傳播中至關(guān)重要[8-9]，而gE基因為主要的毒力基因，能促進病毒顆粒釋放并有嗜神經(jīng)性。

目前，國內(nèi)外主要以滅活疫苗和減毒活疫苗進行免疫防控[10]，最早的減毒活疫苗為天然gE缺失株，之后人們通過基因工程技術(shù)獲得了相應(yīng)的基因缺失疫苗[11]，這類疫苗的應(yīng)用很大程度上減少了該病的流行和擴散。基因缺失疫苗主要以缺失非必需囊膜糖蛋白基因gE為主，它的去除不影響病毒的復(fù)制和免疫原性。在部分歐美國家如德國和美國，已經(jīng)通過gE基因缺失疫苗免疫和相應(yīng)的抗體檢測手段，完全凈化了PR[12]。我國生豬養(yǎng)殖情況較為復(fù)雜，除了可靠的疫苗免疫之外，需要一種簡便快速的gE抗體檢測技術(shù)，促進豬場偽狂犬病的凈化。由于單克隆抗體具有靈敏度高，特異性強等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)診斷中。本研究通過酵母表達gE蛋白并篩選了針對該蛋白的單克隆抗體，為PRV gE抗體快速檢測技術(shù)的研發(fā)及該病的凈化奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒、質(zhì)粒和細胞

PRV(湯陰株)由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室分離、鑒定和保存；pPICZαA-gE重組質(zhì)粒、PK-15細胞均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器

X-33菌株購自美國Invitrogen公司，GE Ni填料和Ni柱購自美國GE公司，1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司，BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，AEC顯色液購自Sigma公司，胰蛋白酶和ECL顯色液購自新賽美生物科技有限公司，HRP-羊抗鼠及HRP-羊抗豬二抗購自Santa Cruz Biotechnology公司，PRV gE單克隆抗體購自VMRD公司，His單克隆抗體及鼠源單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，PRV陰性及陽性血清均來自IDEXX PRV gE檢測試劑盒檢出的臨床樣品，其他分析純試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。LLB、YPD、BMGY、BMMY培養(yǎng)基均按Easy SelectTMPichia Expression Kit Manual說明配制。

PowerPac電泳儀、Mini-PROTEAN?Tetra電泳槽、半干轉(zhuǎn)膜儀、AKTA pure純化儀及電轉(zhuǎn)儀均購自美國BIO-RAD公司，POLARstar Omega全自動多功能酶標儀購自德國BMG Labtech公司。

1.3 重組gE蛋白的表達及純化

1.3.1 重組gE蛋白的表達 將pPICZαA-gE重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)中，涂布于LLB平板(含30 μg/mL博來霉素)，37 ℃過夜培養(yǎng)。在LLB平板中挑取單菌落接種于2 mL LLB培養(yǎng)基中，37 ℃振搖5 h，將菌液按1∶50接種于100 mL LLB培養(yǎng)基中過夜振搖培養(yǎng)，10 000 r/min離心2 min，收集菌體后提質(zhì)粒，并測定其質(zhì)量濃度。

用PmeⅠ限制性內(nèi)切酶單酶切使質(zhì)粒線性化后，取5～10 μg質(zhì)粒與80 μL X-33酵母感受態(tài)(按Easy SelectTMPichia Expression Kit Manual說明制備)混勻。在1.5 kV電壓、25 μF電容、200 Ω電阻條件下電擊4.7 ms，電轉(zhuǎn)進X-33酵母感受態(tài)中，電轉(zhuǎn)結(jié)束立即加入1 mL 1 mol/L山梨醇。在30 ℃條件下靜置培養(yǎng)3 h后，4 000 r/min離心5 min，棄部分上清，剩余涂布于含博來霉素的YPD平板，30 ℃培養(yǎng)3 d。挑取單個圓潤菌落接種于2 mL YPD培養(yǎng)基中，28 ℃振搖培養(yǎng)48 h，按1∶50接種于100 mL YPD培養(yǎng)基中。過夜振搖后，按1∶10接種于BMGY培養(yǎng)基中，振搖36 h后，按1∶5接種于BMMY培養(yǎng)基中，每天加1%甲醇誘導(dǎo)表達。

1.3.1.1 SDS-PAGE鑒定 在誘導(dǎo)表達的第3天取1 mL菌液上清并加入10 μL GE Ni填料，4 ℃下翻轉(zhuǎn)過夜，6 000 r/min離心5 min，棄上清，加入60 μL PBS緩沖液重懸。再向其加入15 μL的5×Loading Buffer，在100 ℃沸水中煮10 min，瞬離并用于上樣鑒定。

1.3.1.2 Westen blot鑒定 蛋白質(zhì)電泳后將聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在甲醇中激活10 s，然后依次將濾紙-PVDF膜-蛋白質(zhì)膠-濾紙放置于半干轉(zhuǎn)膜儀石墨電極，15 V下轉(zhuǎn)1 h。結(jié)束后將膜置于5%脫脂奶粉中進行封閉，37 ℃孵育1 h。分別用His單克隆抗體(以下均為1∶5 000稀釋)和PRV陽性血清(以下均為1∶200稀釋)作為一抗室溫孵育1 h后棄去，PBST反復(fù)洗5次。再分別用HRP-羊抗鼠(以下均為1∶1 000稀釋)和HRP-羊抗豬(以下均為1∶1 000稀釋)二抗室溫孵育1 h后棄去，PBST反復(fù)洗5次。最后滴加ECL顯色液(A液、B液1∶1混合)在化學(xué)成像儀下顯色。

1.3.2 重組gE蛋白的純化 將鑒定正確并已連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d的菌液8 000 r/min、4 ℃離心30 min，取上清，用0.45 μm濾膜過濾，以0.5 mL/min的速度流過Ni柱。配制20 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)、150 mmol/L NaCl平衡緩沖液以及20 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)、150 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑洗脫緩沖液。在AKTA pure純化儀上設(shè)定緩沖液混合比例，用梯度稀釋的咪唑進行洗雜和洗脫，收集洗脫峰。通過透析將蛋白質(zhì)緩沖液置換為20 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)后,用12%的SDS-PAGE進行初步鑒定，同時進行Westen blot分析(參照1.3.1.2)，用His單克隆抗體作為一抗孵育進一步鑒定。用BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒測定質(zhì)量濃度后，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 重組gE蛋白的活性鑒定

1.3.3.1 Dot blot鑒定 分別將1 μL重組gE蛋白和PBS緩沖液(陰性對照)點于硝酸纖維素(NC)膜上，自然風(fēng)干固定，用5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。分別用PRV陽性血清和His單克隆抗體作為一抗室溫孵育1 h后棄去，PBST反復(fù)洗5次。分別用HRP-羊抗豬和HRP-羊抗鼠二抗室溫孵育1 h后棄去，PBST反復(fù)洗5次。最后用ECL超敏顯色液在化學(xué)成像儀中進行顯色。

1.3.3.2 ELISA鑒定 將重組gE蛋白用CBS溶液1∶100稀釋后，按每孔100 μL加入96孔板中，4 ℃過夜包被。5%脫脂奶粉封閉后，用PRV陰性及陽性血清(以下均為1∶200稀釋)室溫孵育1 h后棄去，PBST反復(fù)洗5次。用HRP-羊抗豬二抗室溫孵育1 h后棄去，PBST反復(fù)洗5次。加入顯色液顯色后，用2 moL/L H2SO4終止，放入酶標儀中讀取OD450數(shù)值。

1.4 PRV gE蛋白單克隆抗體的篩選

1.4.1 免疫小鼠 將重組gE蛋白與弗氏完全佐劑按1∶1混合后乳化，以每只小鼠20 μg的劑量對BALB/c小鼠(4只)進行皮下免疫；以弗氏不完全佐劑乳化重組gE蛋白，并按相同方式和劑量于21、42 d進行免疫。最后一次免疫結(jié)束后14 d，采用斷尾取血法采集小鼠血液。分離血清后用ELISA方法檢測血清的抗體效價，效價達標的小鼠在融合前3 d，以每只100 μL的劑量腹腔注射重組gE蛋白。

1.4.2 細胞融合 腹腔注射3 d后，分離出免疫小鼠的脾臟細胞，并將提前培養(yǎng)的SP2/0骨髓瘤細胞與脾細胞按1∶5的比例進行混合，加入37 ℃提前預(yù)熱的50% PEG-4000(pH值8.0)溶液進行細胞融合，加入無血清1640培養(yǎng)基終止細胞融合。用10% FBS-HAT-1640懸浮稀釋細胞，細胞計數(shù)后，按每孔300 μL平鋪于96孔板中，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，待細胞長至孔底面積的1/3～1/2時，取細胞上清進行檢測。

1.4.3 免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)篩選陽性克隆 將PK-15細胞培養(yǎng)在96孔板中，待長至70%～80%時接種病毒，37 ℃孵育1 h后棄去，加入含2% FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。將上清棄掉后每孔均加入100 μL預(yù)冷的無水乙醇，并于-20 ℃固定至少20 min。用5%脫脂奶粉封閉后，取細胞上清作為一抗室溫孵育1 h后棄去，PBST反復(fù)洗5次。用HRP-羊抗鼠二抗室溫孵育1 h后棄去，PBST反復(fù)洗5次。加入50 μL的AEC顯色液進行顯色，作用5～15 min后棄去顯色液，加入100 μL超純水后在顯微鏡下觀察。

1.4.4 亞克隆 選取IPMA反應(yīng)較強且細胞團較少的孔轉(zhuǎn)入24孔板中培養(yǎng)。待細胞長滿后通過有限稀釋法亞克隆，直至得到陽性單克隆。

1.4.5 單克隆抗體的腹水制備 以0.5 mL/只的劑量，向BALA/c小鼠腹腔注射液體石蠟預(yù)先致敏。注射7 d后，將已篩選到的陽性單克隆細胞注射到小鼠腹腔，在第10天收集小鼠腹水，6 000 r/min離心5 min后取上清，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單克隆抗體的鑒定

1.5.1 單克隆抗體效價的測定 用ELISA測定單克隆抗體的效價，將重組gE蛋白包被(參照1.3.3.2)，以10倍倍比稀釋的小鼠腹水作為一抗孵育，以HRP-羊抗鼠作為二抗孵育。用顯色液顯色并用2 moL/L H2SO4溶液終止，最后用酶標儀測定各個稀釋度的OD450數(shù)值。

1.5.2 單克隆抗體與重組gE蛋白的反應(yīng)性 重組gE蛋白電泳后，轉(zhuǎn)膜進行Western blot分析(參照1.3.1.2)，以4株單克隆抗體細胞上清按1∶100稀釋作為一抗孵育，以HRP-羊抗鼠作為二抗孵育，最后用ECL顯色液顯色。

1.5.3 單克隆抗體與病毒的反應(yīng)性 用1.4.3中的IPMA法，分別以4株單克隆抗體細胞上清(1∶100)、PRV陰性血清(陰性對照)和PRV gE單克隆抗體(陽性對照)作為一抗孵育，分別以HRP-羊抗鼠、HRP-羊抗豬和HRP-羊抗鼠作為二抗孵育。用AEC顯色液顯色并用超純水終止，最后在顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5.4 單克隆抗體亞型的鑒定 按照鼠源單克隆抗體亞型鑒定試劑盒說明書進行，鑒定4株單克隆抗體的亞型。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組gE蛋白的表達及純化

2.1.1 重組gE蛋白的表達 取酵母菌液上清進行SDS-PAGE和Western blot鑒定。SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，gE蛋白在X-33酵母中獲得了表達，蛋白質(zhì)大小約68 ku，與目的蛋白大小一致;Western blot鑒定結(jié)果顯示，表達的重組gE蛋白能與His單克隆抗體及PRV陽性血清反應(yīng)，表明表達蛋白活性良好(圖1)。

A：SDS-PAGE結(jié)果(M：蛋白質(zhì)預(yù)染Marker；1：gE蛋白)；

2.1.2 重組gE蛋白的純化 SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示，獲得了高純度的gE蛋白，且純度在90%以上；Western blot鑒定結(jié)果顯示，純化的重組gE蛋白與His單克隆抗體反應(yīng)性較好(圖2)。經(jīng)BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒測定，質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL。

A：SDS-PAGE結(jié)果(M：蛋白質(zhì)預(yù)染Marker；1：純化后gE

2.1.3 重組gE蛋白的活性鑒定 將重組gE蛋白點至NC膜，分別以PRV陽性血清和His單克隆抗體為一抗，通過Dot blot鑒定重組gE蛋白活性，結(jié)果表明，重組gE蛋白具有良好的生物學(xué)活性(圖3)。

A：gE蛋白與陽性血清的反應(yīng)性(1：gE蛋白；2：陰性對照)；

以重組gE蛋白作為包被抗原，以PRV陰性及陽性血清為一抗，通過ELISA鑒定重組蛋白活性，結(jié)果顯示，重組gE蛋白活性良好并能鑒別PRV陰性及陽性血清(圖4)。

圖4 重組gE蛋白的ELISA鑒定Fig.4 ELISA identification of recombinant gE protein

2.2 PRV gE蛋白單克隆抗體的制備

用重組gE蛋白免疫小鼠后，分離小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合，在第7～10天用IPMA法進行初篩。陽性多克隆經(jīng)亞克隆后獲得4株單克隆，分別命名為2F10、4C10、9E1、10C3。將這4株單克隆細胞分別腹腔注射小鼠，獲得了4株gE單克隆抗體的腹水。

2.3 單克隆抗體的鑒定

2.3.1 單克隆抗體的效價 以重組gE蛋白為包被抗原，4株單克隆抗體腹水作為一抗，通過ELISA測定單克隆抗體與重組gE蛋白的反應(yīng)活性。結(jié)果顯示，4株單克隆抗體腹水均能與重組gE蛋白反應(yīng)，效價均達到105以上(圖5)。

圖5 單克隆抗體效價測定結(jié)果Fig.5 Detection results of monoclonal antibodies titer

2.3.2 單克隆抗體與重組gE蛋白的反應(yīng)性 以4株單克隆抗體為一抗，進行Western blot鑒定,結(jié)果顯示，4株單克隆抗體均能識別重組gE蛋白，且特異性較好(圖6)。

M：蛋白質(zhì)預(yù)染Marker；1：2F10與gE蛋白的反應(yīng)；2：4C10與

2.3.3 單克隆抗體與病毒的反應(yīng)性 以4株單克隆抗體為一抗，孵育接種病毒后的PK-15細胞，進行IPMA鑒定，結(jié)果顯示，4株單克隆抗體均能識別PRV，特異性較好(圖7)。

A：2F10與病毒的反應(yīng)；B：4C10與病毒的反應(yīng)；C：9E1與病毒的反應(yīng)；D：10C3與病毒的反應(yīng)；E：陰性對照；F：陽性對照

2.3.4 單克隆抗體亞型的鑒定 使用鼠源單克隆抗體亞型鑒定試劑盒，鑒定出2F10、4C10、10C3等3株單克隆抗體均為IgG2b亞類，9E1為IgG1亞類；4株單克隆抗體的輕鏈均為κ鏈。

3 結(jié)論與討論

PRV能感染圈養(yǎng)和野生動物，但只有豬被認為是PRV動物宿主，因為豬是唯一能在急性感染中存活并潛伏感染的動物。全球曾普遍使用PRV的滅活疫苗和減毒活疫苗，現(xiàn)在通過使用基因缺失疫苗，配合相關(guān)檢測手段，可以區(qū)分野毒感染和疫苗免疫抗體，因而能更好地促進豬場病毒的凈化。雖然一些歐美國家，通過基因缺失疫苗及輔助的抗體檢測技術(shù)已經(jīng)根除了PRV，但由于我國的畜牧業(yè)情況復(fù)雜，許多個體養(yǎng)殖戶難以管理控制。而且我國新出現(xiàn)的變異株使該病的防控變得更加困難[13]，因此，我國仍需要投入大量的研究[14]，并通過有效手段盡早地清除PRV，減少豬場的經(jīng)濟損失[15]。

當前，PRV gE抗體ELISA檢測技術(shù)是養(yǎng)殖場和檢測部門鑒別診斷PRV的主要手段[16]，其結(jié)果可以提示豬群疫苗免疫情況及是否存在野毒感染，為養(yǎng)殖場該病的凈化提供極大的幫助。然而，ELISA檢測技術(shù)成本較高，不便于臨床應(yīng)用，中小豬場使用較少。因此，要研究快速簡便的定量檢測方法，提高中小養(yǎng)殖場該病檢測水平，從而加快我國對該病的凈化。

本研究選用畢赤酵母X-33株為宿主菌，pPICZαA為重組表達載體，成功表達了經(jīng)糖基化修飾的PRV gE蛋白。同時，pPICZαA載體自身攜帶信號肽及His標簽，有利于重組gE蛋白分泌性表達的檢測與純化。利用真核系統(tǒng)表達后，得到了更接近于天然結(jié)構(gòu)的高活性PRV gE蛋白。不足的是，酵母表達周期長且獲得目的蛋白的量較低。因此，仍需對該系統(tǒng)的表達條件進行進一步的探索與優(yōu)化。將PRV gE蛋白免疫小鼠后進行細胞融合，通過IPMA法篩選得到陽性多克隆，并通過有限稀釋法亞克隆獲得陽性單克隆細胞，將陽性單克隆細胞注射到BALA/c小鼠腹腔，收集小鼠腹水得到針對PRV gE蛋白的特異性單克隆抗體[17]。獲得的單克隆抗體特異性強、敏感性良好，能同時識別重組gE蛋白和PRV。本研究成功獲得了針對PRV gE蛋白的特異性單克隆抗體，為PRVgE抗體快速檢測方法的研究，以及PR的臨床鑒別診斷和凈化奠定了基礎(chǔ)。