崔 唱，高夏歡，王曉娜，章 克，陳騰祥*

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

整合素β4的主要功能是維持上皮細(xì)胞的完整性，調(diào)節(jié)半橋粒的的形成；半橋粒是基底細(xì)胞表面的粘附結(jié)構(gòu)[1-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，整合素β4在上皮性卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)也有增高，隨著惡性程度的增高，其表達(dá)也增高。整合素β4在多種腫瘤中均有較高的表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的惡性程度相關(guān)，可以作為腫瘤的早期靶點(diǎn)候選標(biāo)志物[5]。在本研究中，將相同病理類型的上皮性卵巢癌細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)后提取蛋白進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)隨著上皮性卵巢癌細(xì)胞整合素β4表達(dá)程度，探討DMSO對(duì)腫瘤細(xì)胞的惡性質(zhì)及黏附性有什么影響。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 TOV-112D細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞系TOV-112D細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，用1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清（FBS），置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到70%左右，即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理。

1.2 細(xì)胞蛋白的提取

吸盡 PBS，每皿（6 cm 皿）加入80 uL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液（RIPA），搖晃培養(yǎng)皿使其充分覆蓋細(xì)胞，于冰上勻速搖晃裂解約10 min。RIPA中加入蛋白酶抑制劑（PMSF）（RIPA：PMSF=100:1）。

將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 mL離心管中。在高速冷凍離心機(jī)中4℃，12000 r/min，離心20 min；離心，上清轉(zhuǎn)移到0.5 mL的離心管中，放于-80℃保存。

1.3 蛋白含量的測(cè)定（BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒）

按50倍體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50:1）配制適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24 h 內(nèi)穩(wěn)定（A：3750 μL，B：75 μL）。完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10 μL稀釋至100 μL，終濃度為0.5 mg/mL。

用RIPA裂解液90 μL+10 μL標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品按0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的溶液（RIPA 強(qiáng)）補(bǔ)足到20 μL。加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，加用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的溶液至20 μL（1 μL樣品+19 μL RIPA強(qiáng)）。各孔加入200 μL BCA工作液，用恒溫培養(yǎng)振蕩器37℃，80r放置30 min。

1.4 SDS-PAGE 電泳和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）分析

1.4.1 SDS-PAGE 電泳

待到積層膠凝固后，組裝電泳設(shè)備并處理樣品：將蛋白樣品定量后，用上樣緩沖液按照上樣量稀釋樣品（蛋白量：30～60 μg），將制好的樣品100℃加熱變性5 min，瞬時(shí)離心，備用。用20 μL加樣槍貼壁按預(yù)定的順序加樣，制樣量為20 μL/孔。未上樣的上樣孔加入等量的1×樣品緩沖液對(duì)照。積層膠電泳電壓為80 V，分離膠電泳電壓為120 V。電泳總時(shí)間2 h左右當(dāng)指示劑溴酚藍(lán)電泳至底部時(shí)，終止電泳。

1.4.2 蛋白質(zhì)印跡曝光

選擇PVDF膜親水性好的一面貼膠。通電轉(zhuǎn)膜，電流要求恒流300 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為1 h左右。輕輕用眼科鑷取出PVDF膜，將膜放在TBST中，在室溫下?lián)u床上勻速清洗3次，每次5 min。

在室溫下孵育2～3 h或者于4℃冰箱中過夜孵育一抗后，在搖床上用TBST將PVDF膜清洗3次，5 min/次；將同一張PVDF膜于室溫下孵育二抗，孵育1 h（當(dāng)二抗與一抗接合后可以根據(jù)二抗所攜帶的標(biāo)記而顯示出一抗的位置）；搖床上用TBST將膜清洗3 次，5 min/次。通過曝光儀，將PVDF膜上的蛋白進(jìn)行掃描顯影后獲取其圖像并統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

經(jīng)Western blot檢測(cè)（圖1），各泳道在205 kDa處各有一條條帶，即整合素β4。隨著細(xì)胞培養(yǎng)密度的增加，整合素β4的條帶灰度值明顯降低。與1泳道相比，整合素β4在2泳道的灰度值降低，有顯著性差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明DMSO可使細(xì)胞整合素β4的表達(dá)降低，抑制細(xì)胞的黏附，增加細(xì)胞遷移的可能性。

3 結(jié) 論

有研究表明DMSO 具有細(xì)胞毒性。本實(shí)驗(yàn)通過DMSO對(duì)卵巢癌細(xì)胞的研究，進(jìn)一步證明了DMSO可以通過誘導(dǎo)整合素β4下調(diào)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移擴(kuò)增，增加腫瘤的惡病質(zhì)。