孟胤妤，蔣成素，尤孟媛，李會(huì)興，肖雁冰

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院 婦科，貴州 遵義 563000)

左炔諾孕酮宮內(nèi)節(jié)育系統(tǒng)(Levonorgestrel-releasing intrauterine system, LNG-IUS )商品名為“曼月樂”，近年逐步被應(yīng)用于非避孕領(lǐng)域的相關(guān)研究，已被廣泛用于子宮腺肌病的臨床治療[1-3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)LNG-IUS用于治療子宮腺肌病時(shí)存在“病灶閾值”現(xiàn)象[4-5]，即LNG-IUS治療子宮腺肌病效果存在病灶大小的選擇性，這使得我們考慮，在使用LNG-IUS治療子宮腺肌病時(shí)，其有效成分LNG可能在子宮肌壁存在一定的濃度梯度，隨著子宮肌壁厚度的增加，LNG的濃度逐漸降低，直至失去治療效果。為了弄清LNG-IUS治療子宮腺肌病存在“病灶閾值”現(xiàn)象的內(nèi)在原因，為正確應(yīng)用LNG-IUS治療子宮腺肌病提供參考，本研究是在前期研究的基礎(chǔ)上，通過改進(jìn)體模材料、制備技術(shù)制得透明硅膠體模(Transparent silica gel model, TSM)，并對LNG進(jìn)行顯色標(biāo)記，以顏色變化的形式直觀反映M-LNG在TSM壁中的濃度變化，并對M-LNG的彌散規(guī)律進(jìn)行研究，以期為LNG-IUS治療子宮腺肌病存在“病灶閾值”現(xiàn)象的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)，并為宮內(nèi)藥物緩釋系統(tǒng)的研究探索實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 A、B兩種組分的室溫硫化硅膠(東莞市國創(chuàng)有機(jī)硅膠有限公司)；左炔諾孕酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司)；氨基磺酸(成都科隆化學(xué)品有限公司)；異煙肼(純度≥98%，成都科隆化學(xué)品有限公司)；甘油(浙江遂昌惠康藥業(yè)有限公司)；無水乙醇分析純(天津永創(chuàng)化學(xué)試劑廠)；蒸餾水。

1.2.2 M-LNG與LNG性質(zhì)測定 使用無水乙醇溶液對紫外分光光度計(jì)進(jìn)行基線校零，取10 mL 10 mg/mL M-LNG溶于10 mL無水乙醇溶液配制成5 mg/mL M-LNG乙醇溶液，取50 mg LNG溶于10 mL無水乙醇溶液配制成5 mg/mL LNG乙醇溶液，再使用紫外分光光度計(jì)對已配制好的相同濃度的M-LNG乙醇溶液及LNG乙醇溶液進(jìn)行光譜分析。

1.2.3 TSM的制備及其理化性質(zhì)測量 將A、B兩種組分的室溫硫化硅膠按照1∶1的比例分別取250 mL放入500 mL燒杯中，使用電動(dòng)攪拌機(jī)攪拌均勻，再使用真空消泡桶進(jìn)行抽真空脫泡處理，脫泡完畢后將試管插入正中并固定，再將硅膠于室溫中靜置4h，待硅膠固化后抽出試管，即可制得TSM。在37 ℃條件下觀察TSM的質(zhì)地、狀態(tài)、顏色及其穩(wěn)定性；根據(jù)固體密度計(jì)算公式：ρ=m/v，計(jì)算出TSM的密度。

1.2.4 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 因LNG不溶于水，可溶于乙醇溶液，為了制定M-LNG標(biāo)準(zhǔn)曲線，將不同質(zhì)量的M-LNG分別加入10 mL無水乙醇中，配制成M-LNG濃度分別為0.02、0.2、0.3、0.4 mg/mL的溶液，利用紫外分光光度計(jì)，在波長為345 nm處測得不同濃度M-LNG的標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，并根據(jù)吸光度繪制M-LNG標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 M-LNG放入TSM后TSM的顏色變化、M-LNG的吸光度測定及濃度計(jì)算 取5 mL 10 mg/mL M-LNG溶液加入5 mL甘油中，充分?jǐn)嚢杈鶆?。?0份已配制好的該溶液放入30個(gè)TSM腔中，并用石蠟封存，放入37 ℃恒溫水浴箱中進(jìn)行觀察。將30個(gè)已加入M-LNG的TSM按照觀察天數(shù)隨機(jī)分為3組，每組10個(gè)，并將1個(gè)未加入M-LNG的TSM作為空白組進(jìn)行對照。每30 天記錄1次，30 、60、90 d后觀察TSM的顏色變化，并將放置30、60 、90 d的TSM分別取出4個(gè)，以TSM腔壁為中心，向外在1、2、3、4 cm處分別切片，厚度為1 cm[6]。將放置30 d的TSM分為第1組，其中距離TSM腔壁1 cm為A1組、2 cm為B1組、3 cm為C1組、4 cm為D1組；將放置60 d的TSM分為第2組，其中距離TSM腔壁1 cm為A2組、2 cm為B2組、3 cm為C2組、4 cm為D2組；將放置90 d的TSM分為第3組，其中距離TSM腔壁1 cm為A3組、2 cm為B3組、3 cm為C3組、4 cm為D3組。以TSM切片中心為基準(zhǔn)，取15 g置于已加入10 mL無水乙醇的密閉離心管中，并放置于37 ℃恒溫水浴箱中，24 h后取出該溶液，利用紫外分光光度計(jì)測出M-LNG的吸光度，再根據(jù)已測得的曲線回歸方程計(jì)算出M-LNG的濃度。

2 結(jié)果

2.1 M-LNG顯色效果 制成的氨基磺酸異煙肼水溶液呈無色(見圖1)，制成的M-LNG呈黃色(見圖2)，置于37 ℃條件下觀察90 d均未變色。

圖1 制成的氨基磺酸異煙肼水溶液

圖2 制成的M-LNG

2.2 M-LNG與LNG性質(zhì) M-LNG與LNG在波長345 nm處波峰未發(fā)生明顯偏移(見圖3)，表明M-LNG未使LNG的性質(zhì)發(fā)生明顯改變。

圖3 M-LNG與LNG光譜圖

2.3 TSM性質(zhì) 制備出的TSM呈透明狀態(tài)(見圖4)，質(zhì)地較韌，具有彈性，放置于37 ℃恒溫水浴箱中觀察30 、60 、90 d后仍為透明狀態(tài)，重量及體積無改變。制得的TSM重量為515 g，體積為500 mL，根據(jù)密度計(jì)算公式算出TSM密度為1.03 g/mL。

圖4 透明硅膠體模

2.4 M-LNG標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 在波長為345 nm處測得不同濃度的M-LNG標(biāo)準(zhǔn)液吸光度符合曲線回歸方程為：Y=0.3976x+0.0009，r2=0.9996(見圖5)，可利用此曲線回歸方程對待測樣品中的M-LNG濃度進(jìn)行計(jì)算。

圖5 M-LNG濃度與吸光度的關(guān)系

2.5 M-LNG在TSM中的顯色變化及隨彌散距離變化的規(guī)律 將置入M-LNG的TSM放在37 ℃恒溫水浴箱中30 、60、90 d后觀察TSM呈黃色，且TSM腔最深，向外黃色逐漸變淡，每30天記錄1次，能直觀的反映出M-LNG的濃度在TSM中的呈遞減變化(見圖6)。第1組中A1、B1、C1、D1組各組所含M-LNG濃度呈逐漸下降趨勢，符合線性回歸方程：Y=-0.0247x+0.1136，r=0.9937；第2組中A2、B2、C2、D2組各組所含M-LNG濃度呈逐漸下降趨勢，符合線性回歸方程：Y=-0.0243x+0.1135，r=0.9918；第3組中A3、B3、C3、D3組各組所含M-LNG濃度呈逐漸下降趨勢，符合線性回歸方程：Y=-0.0243x+0.1125，r=0.9846。TSM放置30 、60、90 d時(shí)，A、B、C、D組間(彌散距離不同)M-LNG在TSM壁中的濃度隨彌散距離增加而下降(P<0.01)，呈現(xiàn)出距離依賴的“濃度梯度”現(xiàn)象(見表1、圖7)。

A：30d； B：60d ；C：90d。圖6 加入M-LNG后TSM的顏色變化

表1 TSM放置30、60、90d后切片4組所含M-LNG濃度(mg/mL)情況(n=12)

分組30 d60 d90 dFP空白0.0000±0.00000.0000±0.00000.0000±0.0000A 0.0922±0.0078△0.0909±0.0051△0.0906±0.0075△ 0.2000.659B 0.0642±0.0037△ 0.0639±0.0034△ 0.0624±0.0033△1.1350.299C 0.0407±0.0028△0.0385±0.0038△0.0353±0.0030△2.0720.077D 0.0218±0.0013△0.0209±0.0027△ 0.0190±0.0027△0.3420.743F△349.1160503.4120378.7810P△0.00000.00000.0000

△:TSM放置30、60、90 d后，A、B、C、D組間M-LNG濃度比較，P<0.01。

圖7 TSM放置30 d、60 d、90 d后，各組間M-LNG濃度比較

2.6 TSM中M-LNG濃度隨時(shí)間變化的規(guī)律 TSM放置30 、60 、90 d時(shí)，A、B、C、D組內(nèi)(彌散距離相同)，M-LNG濃度隨放置時(shí)間延長稍有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明在一定彌散距離內(nèi)，TSM壁中M-LNG的濃度在一段時(shí)間內(nèi)保持相對穩(wěn)定，呈現(xiàn)出時(shí)間依賴的“濃度穩(wěn)定”現(xiàn)象(見表1、圖8)。

圖8 TSM放置30、60、90 d后，各組內(nèi)M-LNG濃度比較

2.7 TSM中M-LNG濃度遞度的三維重建 本實(shí)驗(yàn)中制成的TSM的形狀與真實(shí)人體子宮存在差別，特將各組所含M-LNG的濃度進(jìn)行數(shù)據(jù)整合，由第三方杭州天邁模型科技有限公司進(jìn)行三維重建(見圖9)，能更好、更直觀的反映出M-LNG在TSM壁中的濃度變化。

A:整體;B:剖面。圖9 TSM三維重建

3 討論

3.1 LNG的顯色反應(yīng) 氨基磺酸是一種白色結(jié)晶，又稱為“固體硫酸”，但腐蝕性卻很小，與皮膚長時(shí)間接觸并無損害，氨基磺酸溶于水，微溶于有機(jī)溶劑中，不揮發(fā)、不吸濕、低毒、性質(zhì)穩(wěn)定[7]。異煙肼為無色結(jié)晶，或白色至類白色的結(jié)晶性粉末，易溶于水。LNG的母環(huán)為甾環(huán)，官能團(tuán)有酮基、醇羥基及乙炔基，這些化學(xué)結(jié)構(gòu)特征在一定條件下可被某些化學(xué)物質(zhì)識別，用于LNG顯色反應(yīng)或鑒定。如甾環(huán)可與酸(硫酸、磷酸等)反應(yīng)，顯黃、橙或深紅色；酮基可與羰基試劑(羥胺、苯肼、2，4-二硝基苯肼、異煙肼等)反應(yīng)呈黃色；醇羥基能使高錳酸鉀退色；乙炔基能與硝酸銀生成白色沉淀等[8]。利用LNG相關(guān)基團(tuán)與不同化學(xué)試劑間的特殊顯色反應(yīng)，就能對LNG及其含量進(jìn)行間接的觀察、測量。建立評價(jià)LNG濃度梯度TSM即是利用這樣的原理，在TSM腔中，植入一定劑量含上述化學(xué)基團(tuán)物質(zhì)標(biāo)記的LNG，通過觀察彩色M-LNG在TSM的彌散，以色彩強(qiáng)弱的形式直觀體現(xiàn)LNG在TSM中的濃度梯度變化。

3.2 M-LNG在TSM中的彌散規(guī)律 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)TSM放置時(shí)間不變時(shí)，M-LNG的濃度在TSM中隨著TSM壁的增厚，呈逐漸下降趨勢，符合線性回歸衰減規(guī)律，孫翠等[6]研究結(jié)果表明LNG的濃度在硅膠仿子宮體模中由體模中心向外逐漸較少，其衰減規(guī)律符合線性回歸，本研究中M-LNG在TSM中的彌散規(guī)律與其研究的LNG在硅膠仿子宮體模中的彌散規(guī)律一致。M-LNG濃度在TSM壁中存在距離依賴的“濃度梯度”現(xiàn)象可能與M-LNG與甘油混合溶液中作為溶質(zhì)的M-LNG的“簡單擴(kuò)散”和“溶質(zhì)濃度差”有關(guān)。簡單擴(kuò)散是物質(zhì)分子通過隨機(jī)分子運(yùn)動(dòng)從高濃度區(qū)域向低濃度區(qū)域的網(wǎng)狀傳播，而物質(zhì)濃度差是決定簡單擴(kuò)散效果的關(guān)鍵因素之一[9]。在不考慮其他因素的情況下，TSM腔中高濃度的M-LNG將會(huì)以“簡單擴(kuò)散”的形式向TSM壁中擴(kuò)散，并在TSM壁中形成濃度由高至低的連續(xù)的“濃度梯度”。因此，TSM壁中M-LNG“濃度梯度”現(xiàn)象的本質(zhì)是由溶質(zhì)濃度差和簡單擴(kuò)散的特性決定。此外，M-LNG、甘油與硅膠三者之間是否會(huì)形成特殊的化學(xué)復(fù)合物結(jié)構(gòu)，并對M-LNG的彌散效果產(chǎn)生影響還有待進(jìn)一步研究。除“濃度梯度”現(xiàn)象外，研究還觀察到M-LNG在TSM壁中存在時(shí)間依賴的“濃度穩(wěn)定”現(xiàn)象，即在相同的彌散距離內(nèi)，M-LNG可在較長時(shí)間保持相對穩(wěn)定。分析原因可能在以下幾方面：一方面，TSM的孔徑可能很小，TSM的主要成份為硅膠，硅膠根據(jù)孔徑大小分為大孔、小孔、微孔和納米孔硅膠[10-11]，本實(shí)驗(yàn)TSM經(jīng)掃描電子顯微鏡放大到2 000倍仍未觀察到相應(yīng)孔徑，因此，推測TSM的孔徑應(yīng)為納米級，從而導(dǎo)致M-LNG在TSM壁中的彌散過程非常緩慢；另一方面，硅膠具有一定的吸附能力[12-13]，可能對M-LNG具有一定吸附作用，并在TSM壁中形成小的“M-LNG儲(chǔ)存庫”，致使TSM壁中M-LNG濃度能在較長時(shí)間內(nèi)保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。本研究的兩個(gè)重要發(fā)現(xiàn)，即M-LNG在TSM壁中同時(shí)存在“濃度梯度”和“濃度穩(wěn)定”的現(xiàn)象可以很好解釋有關(guān)LNG-IUS治療子宮腺肌病存在“病灶閾值”現(xiàn)象的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)[4-5]。“有效藥物濃度”和“持續(xù)作用時(shí)間”是藥物治療疾病有效的兩個(gè)重要因素[14-15]。本研究M-LNG呈現(xiàn)在TSM壁中“濃度梯度”現(xiàn)象提示：當(dāng)TSM壁中M-LNG的濃度下降尚未到達(dá)“有效濃度”以下時(shí)，就能發(fā)揮其治療作用；而“濃度穩(wěn)定”現(xiàn)象則表明：一定范圍內(nèi)，TSM壁中的M-LNG濃度能在較長時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，使M-LNG可以持續(xù)較長時(shí)間發(fā)揮其作用。因此，當(dāng)使用LNG-IUS治療子宮腺肌病時(shí)，在一定子宮體積(或肌壁厚度)范圍內(nèi)LNG-IUS治療有效，超過這個(gè)范圍LNG-IUS將失去治療作用。課題組的相關(guān)研究[4-5]將子宮腺肌病患者根據(jù)超聲子宮肌壁厚度或腺肌瘤最大直徑(Maximum diameter，MD)分為輕度、中度、重度3種程度，當(dāng)MD<30 mm時(shí)，LNG-IUS對子宮腺肌病有治療作用，表現(xiàn)為控制癥狀(痛經(jīng)和經(jīng)量過多)和逆轉(zhuǎn)體征(縮小子宮體積和下調(diào)CA125)；當(dāng)MD 為30～35 mm時(shí)，LNG-IUS能較好控制子宮腺肌病患者的痛經(jīng)并減少月經(jīng)量，但縮小子宮體積和下調(diào)CA125的作用不明顯，遠(yuǎn)期有復(fù)發(fā)現(xiàn)象；當(dāng)MD>35 mm時(shí)，單獨(dú)使用LNG-IUS治療子宮腺肌病無效。并篩選出了單純使用LNG-IUS治療子宮腺肌病的有效病灶閾值為MD≤35 mm(對應(yīng)的子宮體積為V=140.5+35.4 mL)，推薦使用的最佳人群為：MD<30 mm(對應(yīng)的子宮體積為：V=117.4±34.1 mL)。兩年后， Lee等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)子宮體積≥150 mL后，LNG-IUS的治療效果明顯下降，與我們的研究結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)LNG在TSM壁中同時(shí)存在“濃度梯度”和“濃度穩(wěn)定”現(xiàn)象，間接地為LNG-IUS用于治療子宮腺肌病存在“病灶閾值”現(xiàn)象提供了實(shí)驗(yàn)佐證。

3.3 問題與展望 在本實(shí)驗(yàn)研究中，制作TSM的材料較為單一，且TSM畢竟不是生物軟組織，不同于人體子宮組織，不具有活體子宮的血液循環(huán)特點(diǎn)，這些因素使得TSM與真實(shí)人體子宮存在較大的差異。然而，由于仿子宮體模的相關(guān)研究缺乏資料參考，無從借鑒與對比。因此，在未來的研究中，通過改進(jìn)體模制作材料、方法與工藝，制作盡可能接近人類真實(shí)子宮質(zhì)地和循環(huán)特點(diǎn)的仿子宮體模，用于宮內(nèi)藥物緩釋系統(tǒng)的“動(dòng)態(tài)研究”；此外，制作“標(biāo)準(zhǔn)”的透明仿子宮體模，探索可以不通過切開體模，而是采用分光測色計(jì)等儀器設(shè)備直接測定LNG在透明仿子宮體膜壁中的彌散規(guī)律，實(shí)現(xiàn)宮內(nèi)藥物緩釋系統(tǒng)直觀、快捷的“靜態(tài)研究”，都是團(tuán)隊(duì)今后努力的方向。

綜上所述，LNG可被氨基磺酸和異煙肼標(biāo)記顯黃色，這種化學(xué)標(biāo)記并未明顯改變LNG性質(zhì)及在透明硅膠體模中的彌散規(guī)律。M-LNG在透明硅膠體模中彌散規(guī)律符合線性回歸，并同時(shí)存在距離依賴的“濃度梯度”和時(shí)間依賴的“濃度穩(wěn)定”現(xiàn)象，從實(shí)驗(yàn)上證明了左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)治療子宮腺肌病存在“病灶閾值”現(xiàn)象的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)。