溫世榮 于艷紅 王德生 王春利 李緒領(lǐng) 楊 慧

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150001；2.山東省立第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東濟(jì)南 250031；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150001

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是以進(jìn)行性記憶力損害和認(rèn)知功能障礙為特征。異常磷酸化tau（p-tau）蛋白破壞微管穩(wěn)定性及軸漿運輸，致神經(jīng)元凋亡，形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)（NFT），而tau 蛋白聚集而成的雙螺旋（PHFs）是AD 的病理基礎(chǔ)之一[1-3]；B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）有抗凋亡作用。但AD 的p-tau 蛋白與Bcl-2 途徑的關(guān)系尚無明確結(jié)論。本研究旨在利用P8 品系快速老化小鼠（SAMP8）[4-5]評價藥物抑制Bcl-2 后小鼠的空間記憶能力，比較Bcl-2、p-tau 蛋白、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）等水平的變化，解析其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3 月齡SAMP8 小鼠6 只、6 月齡SAMP8 小鼠12 只、6 月齡抗快速老化系1（SAMR1）小鼠6 只均由天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供（合格證書編號：0004580）。小鼠均為健康雄性清潔級小鼠，無特定病原體級動物環(huán)境飼養(yǎng)。本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理編號：2016011）。

1.2 主要儀器與試劑

小鼠Morris 水迷宮儀（黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)）；自動數(shù)據(jù)采集及處理系統(tǒng)（黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)）；尼康50i 研究型正置顯微鏡；NIS-Elements F3.21 圖像采集軟件（Nikon Inc.Japan）；圖像分析軟件（imagepro-plus 6.0，Media Cybernetics，Silver Spring，Maryland，USA）。Obatoclax mesylate（GX15-070，武漢博士德生物工程有限公司，BA3971）；Rabbit Anti-Caspase-3（P11）；Rabbit Anti-BCL-2；p-tau 蛋白（sc-101813）；兔二抗等。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分組。A 組為6 月齡SAMR1 小鼠6 只、B 組為3 月齡SAMP8 小鼠6 只，均作為對照組；C 組為6 月齡SAMP8 小鼠6 只（假治療組）；O 組為6 月齡SAMP8 小鼠6 只（藥物組）。O 組腹腔注射Obatoclax 0.2 mL，C 組注射等量生理鹽水，連續(xù)干預(yù)14 d。

1.3.2 水迷宮實驗 實驗訓(xùn)練階段連續(xù)進(jìn)行6 d。將定向航行小鼠面向池壁隨機(jī)取東、西、南、北4 個起始位置之一，記錄小鼠找到水下平臺所需的時間（s）即潛伏期。第1、2 天訓(xùn)練（可視平臺），第3～5 天定向航行（隱蔽平臺），第6 天空間探索（去平臺）。實驗過程使用圖像采集分析系統(tǒng)記錄游泳軌跡?？臻g搜索動物由原象限對側(cè)入水，記錄進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)。

1.3.3 藥物干預(yù)及二次水迷宮實驗 初次水迷宮后，C 組腹腔注射0.9%生理鹽水0.2 mL/只；O 組腹腔注射等量的Obatoclax 3 mg/（kg·d）；每日1 次，連續(xù)2 周。A 組和B 組不做干預(yù)。按初次方法重復(fù)水迷宮實驗并采集數(shù)據(jù)。

1.3.4 灌注取腦及切片 二次水迷宮后的小鼠開胸經(jīng)左心室插管至升主動脈，快速灌注生理鹽水60～100 mL、隨后灌注4%多聚甲醛100～150 mL，取腦組織，固定，脫水，連續(xù)冠狀切片，厚度為3 μm。

1.3.5 免疫組化染色 石蠟切片，脫蠟，脫水，修復(fù)，兔血清封閉。一抗Bcl-2（1∶200）、Caspase-3（1∶100）、p-tau蛋白（1∶80）4℃過夜。兔二抗IgG 室溫孵育20 min。二氨基聯(lián)苯胺法染色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.3.6 結(jié)果判讀 每個標(biāo)本取5 張切片，高倍鏡（400×）下觀察海馬區(qū)不重疊的5 個視野并拍照，記錄陽性細(xì)胞（棕黃色）數(shù)。圖像分析系統(tǒng)測定積分光密度（IOD值），IOD 值=area×平均光密度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮實驗

A、B、C 三組兩次水迷宮的潛伏期和穿過平臺次數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。在第二次水迷宮實驗中，O 組的潛伏期明顯延長，穿過平臺次數(shù)顯著減少，且O 組潛伏期明顯長于B 組及C 組，B、C組長于A 組，B 組長于C 組；O 組穿越平臺次數(shù)少于B組及C 組，B、C 組少于A 組，C 組少于B 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組動物水迷宮結(jié)果比較（±s）

表1 各組動物水迷宮結(jié)果比較（±s）

注：與本組第一次比較，*P ＜0.05；與A 組同期比較，△P ＜0.05；與B 組同期比較，◇P ＜0.05；與C 組同期比較，#P ＜0.05

2.2 免疫組化染色結(jié)果

2.2.1 Bcl-2 與A 組比較，C 組表達(dá)Bcl-2 的IOD 值和陽性細(xì)胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）；與C 組比較，O 組表達(dá)Bcl-2 的陽性細(xì)胞計數(shù)顯著增加（P ＜0.05）。見圖1、表2。

2.2.2 Caspase-3與A組比較，C組和O組表達(dá)Caspase-3 的IOD 值顯著增加（P ＜0.05）；O 組表達(dá)Caspase-3 的IOD 值與C 組比較，各組陽性細(xì)胞計數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖2、表3。

圖1 各組小鼠海馬區(qū)表達(dá)Bcl-2 的陽性細(xì)胞情況

表2 A 組、C 組與O 組Bcl-2 的IOD 值和陽性細(xì)胞計數(shù)比較（±s）

表2 A 組、C 組與O 組Bcl-2 的IOD 值和陽性細(xì)胞計數(shù)比較（±s）

注：與C 組比較，*P ＜0.05。Bcl-2：B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2

圖2 各組小鼠海馬區(qū)表達(dá)Caspase-3 的陽性細(xì)胞情況

表3 A 組、C 組和O 組Caspase-3 的IOD 值和陽性細(xì)胞計數(shù)比較（±s）

表3 A 組、C 組和O 組Caspase-3 的IOD 值和陽性細(xì)胞計數(shù)比較（±s）

注：與A 組比較，*P ＜0.05。Caspase-3：半胱氨酸蛋白酶-3

2.2.3 p-tau 蛋白 與A 組比較，C 組和O 組p-tau蛋白的IOD 值顯著增加（P ＜0.05）；O 組p-tau 蛋白的IOD 值與C 組比較，各組陽性細(xì)胞計數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表4。

表4 A 組、C 組和O 組p-tau 蛋白IOD 和陽性細(xì)胞計數(shù)比較（±s）

表4 A 組、C 組和O 組p-tau 蛋白IOD 和陽性細(xì)胞計數(shù)比較（±s）

注：與A 組比較，*P ＜0.05

3 討論

AD 以進(jìn)行性認(rèn)知功能損害為特征，發(fā)病率隨年齡增長而增加，是嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)和社會問題。SAMP8 小鼠和SAMR1 小鼠由日本京都大學(xué)竹田俊男培育，SAMP8小鼠的腦部病理及學(xué)習(xí)記憶功能衰退與AD 類似。本研究中水迷宮實驗結(jié)果亦驗證了SAMP8 小鼠增齡性空間記憶功能減退的特性。

細(xì)胞凋亡在AD 神經(jīng)元特別是海馬區(qū)[6-7]丟失中扮演重要角色。Bcl-2 家族蛋白與凋亡關(guān)系密切，Bcl-2為抗凋亡亞家族代表，屬于細(xì)胞內(nèi)膜蛋白，與家族內(nèi)促凋亡蛋白Bax 或者Bax/Bak 聚合體結(jié)合，可抑制凋亡級聯(lián)反應(yīng)。神經(jīng)元Bcl-2 減少可致?lián)p傷敏感[8-9]。SAMP8 小鼠腹腔注射Bcl-2 拮抗劑Obatoclax 后學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)一步減退，一方面提示Bcl-2 抑制劑具有加速老化作用，同時也提醒臨床醫(yī)生在應(yīng)用該類藥物抗腫瘤等治療時應(yīng)注意可能存在認(rèn)知方面的副作用[10]。

Obatoclax 通過抑制Bcl-2 發(fā)揮促凋亡作用，而本研究結(jié)果卻與預(yù)期結(jié)果不一致，可能與效應(yīng)蛋白化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。Bcl-2 家族成員含有BH1、BH2、BH3、BH4 4 個功能域，Obatoclax 是擬BH3 結(jié)構(gòu)，與Bcl-2 結(jié)合，使Bcl-2 的BH3 結(jié)合活性喪失，而抑制抗凋亡功能。也有研究顯示，Obatoclax 促進(jìn)僅含BH3 結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白Noxa 與抗凋亡蛋白Bcl-2 結(jié)合，使促凋亡蛋白Bax 或Bax/Bax 聚合體釋放，或直接激活Bax/Bax聚合體促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11-13]。因此，本研究推測Obatoclax 可能促使Bcl-2 與Bax 或Bax/Bak 解聚，導(dǎo)致Bcl-2 一過性增多。將在下一步實驗中驗證Obatoclax應(yīng)用后Bcl-2 表達(dá)是否有時效性。

Caspase 是細(xì)胞凋亡的重要執(zhí)行者[14-15]。Caspase分為凋亡啟動因子（Caspase-9、Caspase-8、Caspase-10）及凋亡效應(yīng)器（Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7）。Caspase-3 是哺乳動物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵酶，研究認(rèn)為Bcl-2 不僅作用在Caspase-3 上游，而且也是Caspase-3 的直接底物，二者在神經(jīng)元凋亡中起著關(guān)鍵性作用[16-18]。微管是神經(jīng)細(xì)胞中參與胞體與軸突營養(yǎng)輸送通道，tau 蛋白有促進(jìn)微管裝配及穩(wěn)定微管的作用[19]，p-tau 蛋白形成PHFs 是AD 神經(jīng)元退化的基礎(chǔ)。Bcl-2 可抑制Caspase-9、Caspase-3 的活性，阻止tau蛋白聚集成PHFs 減緩AD 進(jìn)展，或直接穩(wěn)定微管、保護(hù)神經(jīng)元骨架的穩(wěn)定性[15-16，20]。Yeh 等[21]發(fā)現(xiàn)p-tau 蛋白過度表達(dá)的細(xì)胞Bcl-2 失活形式增多，可抑制Bcl-2抗凋亡作用。這些研究提示Bcl-2 與p-tau 蛋白和Caspase 之間存在復(fù)雜聯(lián)系。

本實驗中O 組與C 組比較，p-tau 蛋白和Caspase-3 的陽性細(xì)胞表達(dá)雖有增多趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這可能與實驗動物樣本量偏小有關(guān)，可以通過增大樣本量進(jìn)一步驗證；另一方面也可能是因為Bcl-2 位于p-tau 蛋白和Caspase-3 的下游，或是通過獨立于二者的路徑發(fā)揮作用。本實驗中Caspase-3 和p-tau 蛋白的表達(dá)呈相同趨勢，符合以往研究所顯示的tau 蛋白是Caspase-3 的底物，經(jīng)Caspase-3 裂解生成p-tau 蛋白。

綜上所述，本實驗顯示在認(rèn)知變化過程中Bcl-2是一個關(guān)鍵成分，記憶力減退可能不是通過Caspase-3和p-tau蛋白途徑發(fā)揮作用。