夏振宇 張衛(wèi)星 王紅芳 劉振國 王穎 胥保華

（山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安 271018）

1 前言

在蜜蜂的生理代謝中，礦物質(zhì)的作用非常重要，不僅參與歧化反應(yīng)，也是調(diào)節(jié)血淋巴與組織液滲透壓的重要因素[1]。微量元素是蜜蜂機體組織中的重要營養(yǎng)物質(zhì)，微量元素占蜜蜂個體干物質(zhì)的6.2%~6.7%[2]。在糖飼糧中添加微量元素也能延長蜜蜂工蜂16.5%~32.7%的壽命[3]。

錳是動物體內(nèi)重要的礦物元素之一，錳能促進動物體內(nèi)的內(nèi)分泌活動和提高動物機體免疫功能，還參與動物氧化還原過程[4]。錳不僅僅參與構(gòu)造動物體內(nèi)的金屬酶，還是許多酶的激活劑[5]。前人研究表明，隨著蜜蜂日齡的增長，其體內(nèi)的錳元素含量會逐漸增加，在蜜蜂飼糧中補充適量的錳會促進蜜蜂的生長發(fā)育[6]。因此，有必要按蜜蜂生長發(fā)育的需求在人工飼糧中添加微量元素錳。

意大利蜜蜂的生長發(fā)育中需要一定水平的錳來滿足其需要。為了進一步探明錳對蜜蜂生長發(fā)育和生理機能的影響，本研究以意大利蜜蜂為研究對象，通過在蜜蜂幼蟲飼糧中添加不同濃度的錳，開展室內(nèi)幼蟲飼養(yǎng)試驗，對蜜蜂生長發(fā)育、機體生理生化指標以及相關(guān)基因表達等進行測定和觀察，力求探明錳對蜜蜂的營養(yǎng)作用及機制。

2 材料與方法

2.1 試驗動物

意大利蜜蜂。

2.2 試驗設(shè)計

從姊妹蜂群中移取2日齡（2d）意大利蜜蜂工蜂幼蟲1200只，隨機分成5組，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)48只幼蟲，并置于室內(nèi)恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為34℃，濕度為50%±5%。其中1組為對照組，飼喂基礎(chǔ)飼糧；其余4組為試驗組，分別在基礎(chǔ)飼糧中添加不同水平的葡萄糖酸錳，添加水平分別為2.00mg/kg、3.00mg/kg、4.00mg/kg、5.00mg/kg，配方如表1所示。分別采集3d、5d、7d幼蟲樣本，測定生理生化指標和相關(guān)基因表達水平；統(tǒng)計各組化蛹率、羽化率。

表1 幼蟲人工飼糧配方及錳水平

表2 基因引物序列

2.3 測定指標及相關(guān)方法

2.3.1 蜜蜂幼蟲生長發(fā)育指標的測定

從每試驗組中隨機選取發(fā)育正常的1日齡幼蟲120只，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)24只幼蟲。從1日齡飼養(yǎng)至7日齡，轉(zhuǎn)移幼蟲至化蛹板化蛹，化蛹率為成功化蛹的幼蟲數(shù)占用于測定幼蟲的化蛹率幼蟲總數(shù)的百分數(shù)。繼續(xù)飼養(yǎng)，直到所有蛹羽化，羽化率為成功羽化的幼蟲數(shù)占成功化蛹的幼蟲數(shù)目的百分數(shù)。

2.3.2 蜜蜂幼蟲體內(nèi)生理生化指標的測定

用雙抗體一步夾心法試劑盒測定蜂體的蛋白質(zhì)濃度、總抗氧化能力（T-AOC）、含錳超氧化物歧化酶活性（MnSOD）、含錳過氧化氫酶活性（MnCAT）和精氨酸酶活性（Arginase）。4種抗氧化酶活性均用蜂體蛋白質(zhì)濃度進行校準[7]。

2.3.3 蜜蜂幼蟲體內(nèi)相關(guān)基因表達量的測定

用qRT-PCR法檢測抗氧化酶相關(guān)基因表達量、精氨酸酶基因表達量。目的基因引物設(shè)計參考序列來自于NCBI數(shù)據(jù)庫，以β-actin為內(nèi)參，委托上海生工生物科技有限公司完成，引物序列如表2所示。

2.3.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件進行單因素方差分析，結(jié)果表示為平均值±標準差，P<0.05表示差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 錳對蜜蜂幼蟲生長發(fā)育的影響

試驗結(jié)果表明，幼蟲人工飼糧中錳的添加水平對蜜蜂化蛹率和羽化出房率的影響不顯著（P>0.05），但與對照組相比，幼蟲飼糧中錳添加水平為4.00mg/kg時，錳能夠提高意大利蜜蜂幼蟲化蛹率和羽化出房率。

3.2 錳對蜜蜂幼蟲體內(nèi)生理生化指標的影響

圖1 錳對蜜蜂幼蟲化蛹率的影響

圖2 錳對蜜蜂幼蟲羽化率的影響

由圖3可以看出，隨著飼糧中錳添加水平的升高，幼蟲體內(nèi)的MnSOD活性顯著升高（P<0.05）。

由圖4可以看出，隨著飼糧中錳添加水平的升高，幼蟲體內(nèi)的MnCAT活性顯著升高（P<0.05）。

由圖5可以看出，隨著飼糧中錳添加水平的升高，幼蟲體內(nèi)的T-AOC活性顯著升高（P<0.05）。

3.3 錳對蜜蜂幼蟲體內(nèi)相關(guān)基因表達量的影響

與對照組相比，當幼蟲飼糧中錳添加4.00mg/kg時，幼蟲體內(nèi)的MnSOD基因表達量顯著升高（P<0.05）。

錳顯著影響不同日齡蜜蜂幼蟲MnCAT基因的相對表達量，3日齡幼蟲3mg/kg處理組MnCAT基因的相對表達量顯著高于對照組和其他處理組（P<0.05）。5日齡幼蟲3mg/kg、4mg/kg處理組MnCAT基因的相對表達量顯著高于對照組和其他處理組（P<0.05）。

綜合以上結(jié)果，以室內(nèi)飼養(yǎng)5日齡幼蟲MnSOD活性做擬合曲線，得到室內(nèi)飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲人工飼糧中錳的適宜添加水平為2.96mg/kg。

4 討論

4.1 蜜蜂飼糧中補充Mn可促進蜜蜂生長發(fā)育

圖3 不同錳添加水平的糖漿飼料對各日齡成年工蜂MnSOD酶活性的影響

圖4 不同錳添加水平的糖漿飼料對各日齡成年工蜂MnCAT酶活性的影響

圖5 不同錳添加水平的糖漿飼料對各日齡成年工蜂T-AOC活性的影響

圖6 不同錳添加水平的糖漿飼料對各日齡成年工蜂體內(nèi)MnSOD基因表達量的影響

圖7 不同錳添加水平的糖漿飼料對各日齡成年工蜂體內(nèi)MnCAT基因表達量的影響

在蜜蜂飼糧中補充適量的Mn會促進蜜蜂的生長發(fā)育。對其他動物的研究發(fā)現(xiàn)，團頭魴獲得最大增重率和特定生長率的飼料錳含量為12.9mg/kg，在飼料中添加適量的錳能促進團頭魴的生長，當飼料中錳含量大于23.16mg/kg時，會造成團頭魴生長受阻[8]。本試驗結(jié)果基本與上述研究結(jié)果類似，意大利蜜蜂幼蟲獲得最大化蛹率和羽化率的飼料錳含量為4mg/kg。證明飼糧中添加適量的錳能促進意大利蜜蜂幼蟲的生長，提高蜜蜂幼蟲的存活能力和抵抗外界不良應(yīng)激的能力。當錳含量由2mg/kg上升至4mg/kg時，化蛹率和羽化率都持續(xù)升高。所以，當人工飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲時，可以考慮適當添加錳，促進蜜蜂幼蟲生長發(fā)育。

4.2 蜜蜂飼糧中補充Mn可提高蜜蜂的抗氧化能力

SOD活性的高低反映機體清除O2—的能力，即SOD活性越高，機體清除O2—的能力越強。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)SOD有3種。其中MnSOD的主要功能是將細胞代謝產(chǎn)生的O2—歧化成H2O2，從而維持線粒體等亞細胞器膜的完整性和正常功能[9]。研究發(fā)現(xiàn)，動物飼糧中錳的添加水平直接影響MnSOD活性[10]。

在飼料中錳含量對方格星蟲稚蟲抗氧化酶活性的影響研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中錳含量對方格星蟲稚蟲體腔液中MnSOD活性有顯著影響，當飼料中錳的添加水平為28.67mg/kg時，方格星蟲稚蟲體內(nèi)的MnSOD活性最高，但添加濃度過高時，方格星蟲稚蟲體內(nèi)的MnSOD活性就會減弱[11]。本研究與上述研究結(jié)果相似，飼料中補充錳元素對意大利蜜蜂幼蟲體中MnSOD活性有顯著影響。隨著飼糧中錳添加水平的升高，幼蟲體內(nèi)的MnSOD活性顯著升高（P<0.05）。錳添加水平為3mg/kg時，幼蟲體內(nèi)的MnSOD活性達到最高，7日齡幼蟲體中的MnSOD活性隨著飼料中錳含量的升高出現(xiàn)上升趨勢。分析其原因可能是，意大利蜜蜂幼蟲從對照組飼糧中吸收較少，錳的減少會使MnSOD結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，Mn作為MnSOD的活性中心的作用減弱，降低MnSOD的活性。當蜜蜂幼蟲攝入適量的錳時，會加強蜜蜂幼蟲體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用，這一代謝的產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量升高，機體的內(nèi)自穩(wěn)機制使蜜蜂幼蟲體內(nèi)抗氧化作用代償性加強，蜜蜂幼蟲體內(nèi)MnSOD活性增高，且錳充分發(fā)揮作為MnSOD的活性中心作用。而7日齡幼蟲對錳的需求量大于3、5日齡，因此隨本實驗人工飼糧所添加的錳濃度梯度升高，MnSOD的活性會持續(xù)增高。

生物體內(nèi)存在的過氧化氫酶，CAT可分解蜜蜂體內(nèi)歧化反應(yīng)所積存的過氧化氫（2H2O2→O2+2H2O），減少體內(nèi)H2O2與O2反應(yīng)所生成的有害物質(zhì)。目前已知的過氧化氫酶有兩類：一類含血紅素基（heme）；另一類不含血紅素基（nonheme），但含有錳，稱為錳過氧化氫酶（MnCat）[12]。人工飼料育蠶比桑葉育蠶的CAT活力高2%~10%，說明不同飼料對CAT有一定的影響[13]。本研究結(jié)果表明，飼料中錳含量對蜜蜂幼蟲體中MnCAT活性有顯著影響，隨著飼糧中錳添加水平的升高，幼蟲體內(nèi)的MnCAT活性顯著升高（P<0.05）。7日齡幼蟲體中的MnCAT活性隨著飼料中錳含量的升高呈現(xiàn)上升趨勢，可能是意大利蜜蜂從飼料中吸收微量的錳，錳的減少使得MnCAT結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，Mn作為MnCAT活性中心的作用不能發(fā)揮，造成MnCAT的活性下降。隨著人工飼糧中錳含量的增加，蜜蜂幼蟲機體的內(nèi)自穩(wěn)機制會使蜜蜂體內(nèi)抗氧化作用出現(xiàn)代償性強化，體內(nèi)MnCAT活性代償性增高，產(chǎn)生高濃度的H2O2，因此MnCAT活性增高。在7日齡時，幼蟲對錳的需要量大于3、5日齡，所以MnCAT活性隨著飼料中錳含量的升高而呈現(xiàn)上升趨勢。

圖8 5日齡幼蟲Mn-SOD活性擬合曲線

總抗氧化能力（T-AOC）反映蜜蜂的總抗氧化系統(tǒng)功能，可清除蜜蜂體內(nèi)自由基，減少氧化損傷。錳元素主要以離子狀態(tài)作為酶活化因子或組成部分在昆蟲體內(nèi)抗氧化機制中發(fā)揮其作用[14]。實驗結(jié)果表明，飼糧中錳添加濃度的變化能夠影響蜜蜂幼蟲總抗氧化能力的變化，隨著飼糧中錳添加水平的升高，幼蟲體內(nèi)的T-AOC活性顯著升高（P<0.05）。當添加量在3mg/kg時，幼蟲抗氧化能力達到最高，當高于3mg/kg添加量時抗氧化能力較低，可能是因為過量的錳會與其他礦物質(zhì)發(fā)生拮抗作用，影響蜜蜂對其他礦物質(zhì)的吸收，將會造成蜜蜂幼蟲內(nèi)環(huán)境紊亂，也會使一些酶活性降低。

4.3 Mn影響蜜蜂錳相關(guān)基因表達

酶相關(guān)基因的表達量和翻譯后的剪切修飾影響酶活性的高低，錳能通過調(diào)節(jié)錳依賴性酶來調(diào)節(jié)DNA和RNA的合成與分解影響基因的表達量和翻譯后的剪切修飾[15]，從而影響該酶的活性。MnSOD活性與MnSOD基因相對表達量密切相關(guān)，意大利蜜蜂幼蟲MnSOD活性與蜜蜂MnSOD基因相對表達量受到飼糧中錳水平的影響，較高的酶基因表達量與較高的酶活性有正相關(guān)關(guān)系，3、5日齡幼蟲4mg/kg處理組MnSOD酶活性顯著高于對照組和其他試驗組，且MnSOD基因的相對表達量也顯著高于對照組和其他組。這可能是因為適宜的錳含量使MnSOD表達量較高，造成MnSOD酶活性增高，最終表現(xiàn)出其基因表達量與酶活性一致的效果。錳對于蜜蜂MnSOD酶基因表達量的影響與錳對MnSOD酶活性的影響有一致的作用。同樣，飼糧中適宜的錳含量也會使意大利蜜蜂MnCAT基因相對表達量升高。3、5日齡幼蟲4mg/kg處理組MnCAT酶活性顯著高于對照組和其他試驗組，MnCAT基因的相對表達量也顯著高于對照組和其他試驗組，可能是因為適宜的錳含量使MnCAT基因表達量較高，造成MnSOD酶活性增高。

5 結(jié)論

本研究首次探明了錳對幼蟲生長發(fā)育和生理機能的影響，對室內(nèi)飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲人工飼糧中適宜錳的添加水平進行了研究。錳對蜜蜂生長發(fā)育有促進作用。在意大利蜜蜂幼蟲飼料中補充適量的錳時，且錳的添加水平大約在2.96mg/kg時，能夠提高幼蟲的抗氧化能力。