王宇陽(yáng) 張浩軍 路曉光 劉童童 綜述 占永立 審校

糖尿病腎病(DN)是終末期腎病的重要原因，也是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟預(yù)測(cè)，到2035年，全球糖尿病患者人數(shù)將從2013年的3.82億增加到5.92億，給患者和社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜不清，降壓、降糖和抑制腎素-血管緊張素-醛固酮軸以減少蛋白尿產(chǎn)生等作為目前的主要干預(yù)措施，療效差強(qiáng)人意[2]。因此，探尋有效的防治策略，改善與提升DN的治療水平迫在眉睫。自噬作為細(xì)胞內(nèi)一種以自我降解途徑清除誤折疊蛋白和損傷細(xì)胞器的生理、病理過(guò)程，是細(xì)胞存活和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，成為代謝相關(guān)疾病的研究熱點(diǎn)。近期研究顯示糖尿病腎臟存在顯著自噬失調(diào)[2]，腎固有細(xì)胞，包括足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、近端腎小管上皮細(xì)胞等均出現(xiàn)明顯自噬信號(hào)異常，提示其在DN發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，有望成為DN防治的新靶標(biāo)。

自 噬

自噬是真核細(xì)胞中普遍存在的一種高度保守的細(xì)胞自我消化途徑，通過(guò)溶酶體降解、清除和循環(huán)利用細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)壽命蛋白和損傷細(xì)胞器來(lái)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，是細(xì)胞重要的自我保護(hù)機(jī)制。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有三種類型自噬：巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy)。巨自噬即通常所稱自噬[3]，目前研究最為廣泛，其生物學(xué)過(guò)程是在即將發(fā)生自噬的細(xì)胞質(zhì)周?chē)纬呻p層膜結(jié)構(gòu)的吞噬泡，并不斷延伸擴(kuò)張形成自噬體，最終自噬體與溶酶體結(jié)合，利用溶酶體水解酶降解其包裹的內(nèi)容物。在此過(guò)程中胞漿型LC3I向膜結(jié)合型LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化標(biāo)志著自噬體的形成，故LC3Ⅱ已被公認(rèn)為是自噬標(biāo)志物。p62/SQSTM1能和LC3Ⅱ相互作用，隨后與其結(jié)合的泛素化蛋白或細(xì)胞器被包裹入自噬體后降解。當(dāng)自噬功能受損時(shí)，p62/SQSTM1將在細(xì)胞內(nèi)蓄積，故其常用于檢測(cè)自噬流。

自噬主要作用包括兩個(gè)方面[4]，一是在饑餓時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)再循環(huán)為機(jī)體提供能量。二是病理?xiàng)l件下通過(guò)清除損傷細(xì)胞器和凝集蛋白，幫助對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)外多種應(yīng)激。自噬受30多種自噬相關(guān)基因(Atg)和相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控[2-4]，營(yíng)養(yǎng)感知通路單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)和SIRT分別通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)AMP和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)水平激活自噬。能量過(guò)?；蛏L(zhǎng)因子刺激能上調(diào)哺乳動(dòng)物雷帕霉素復(fù)合物1(mTOR1)表達(dá)，抑制自噬。AMPK和mTOR1分別與Unc-51樣自噬活化激酶1(ULK1)復(fù)合物不同位點(diǎn)結(jié)合，從而發(fā)揮截然相反的作用，AMPK能通過(guò)抑制mTOR1活化進(jìn)而激活自噬。

DN與自噬受損

自噬和DN的關(guān)系目前尚未闡明，但越來(lái)越多的研究證實(shí)1型和2型糖尿病患者腎小球和腎小管中存在自噬受損。在STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠[6]、db/db糖尿病小鼠[5]和BTBR ob/ob糖尿病小鼠[7]等多種DN動(dòng)物模型中腎臟自噬水平均明顯下調(diào)，且與白蛋白尿、腎小球高濾過(guò)、系膜增寬等病理變化密切相關(guān)。此外，在2型糖尿病患者近端小管的腎活檢標(biāo)本中檢測(cè)到p62/SQSTM1的蓄積[8]，外周血清自噬標(biāo)記物Beclin-1減少[9]，提示DN患者自噬功能缺陷。盡管糖尿病腎臟自噬能力下降，但高暴露于細(xì)胞應(yīng)激環(huán)境促使腎臟對(duì)自噬的需求增加，這一矛盾可能是DN發(fā)生發(fā)展的重要因素。反之，增強(qiáng)自噬能夠改善高糖誘導(dǎo)的腎損傷。腎臟四種固有細(xì)胞作為腎臟結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)，可能是自噬發(fā)揮腎保護(hù)作用的靶標(biāo)，下文逐一綜述自噬和固有細(xì)胞的關(guān)系(圖1)。

圖1 腎固有細(xì)胞自噬抑制介導(dǎo)糖尿病腎病

足細(xì)胞足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的最后一道防線，對(duì)維持腎臟正常生理功能尤為關(guān)鍵，研究發(fā)現(xiàn)生理狀態(tài)下足細(xì)胞自噬基線水平較高，提示自噬是維持足細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的基本自我修復(fù)機(jī)制之一。

自噬功能缺失可能與糖尿病腎小球病變有關(guān)，糖尿病足細(xì)胞功能障礙可引起大量蛋白尿，造成腎損傷。體外培養(yǎng)的永生鼠足細(xì)胞在高糖誘導(dǎo)下，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3I表達(dá)降低，自噬溶酶體降解底物p62/SQSTM增加，足細(xì)胞標(biāo)記蛋白synaptopodin顯著減少，表明高糖可介導(dǎo)足細(xì)胞損傷和自噬缺失[10]。晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGEs)能干預(yù)自噬體和自噬溶酶體形成，阻斷足細(xì)胞自噬流[11]。鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中足細(xì)胞特異性Atg5被敲除后，腎小球?yàn)V過(guò)屏障受損，表現(xiàn)為腎小球系膜增寬、基膜增厚、足突融合消失，最終出現(xiàn)腎小球硬化[12]。對(duì)2型糖尿病患者和OLETF大鼠、db/db小鼠等動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)[11,13]，足細(xì)胞自噬不足在DN進(jìn)展為大量蛋白尿的過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，足細(xì)胞損傷并伴有大量蛋白尿時(shí)，可見(jiàn)LC3斑點(diǎn)和p62/SQSTM1積聚，而無(wú)蛋白尿或僅少量蛋白尿時(shí)則無(wú)上述現(xiàn)象。提示足細(xì)胞自噬受損在DN大量蛋白尿的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高糖或糖尿病狀態(tài)下足細(xì)胞自噬的變化具有時(shí)間依賴性。給予GFP-LC3轉(zhuǎn)染小鼠注射STZ 4周后，足細(xì)胞LC3熒光增強(qiáng)，LC3B-II蛋白表達(dá)增加，下游底物p62/SQSTM1含量降低，表明自噬被明顯激活[12]。8周后小鼠足細(xì)胞GFP-LC3減少，p62/SQSTM1聚集，提示自噬下調(diào)，并且出現(xiàn)腎小球病變。這一現(xiàn)象在高糖培養(yǎng)的SVI足細(xì)胞系也得到了證實(shí)。上述結(jié)果提示，短時(shí)間高糖刺激通過(guò)激活自噬維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，保護(hù)腎臟功能，而長(zhǎng)期的高糖環(huán)境使細(xì)胞自我防御機(jī)制超負(fù)荷，導(dǎo)致自噬下調(diào)，DN進(jìn)展進(jìn)一步加重。Jin[14]等研究發(fā)現(xiàn)，自噬抑制劑3-MA或bafilomycin A1預(yù)處理能削弱黃連素對(duì)高糖應(yīng)激的保護(hù)作用，促進(jìn)足細(xì)胞凋亡。機(jī)制研究證實(shí)[14]，高糖或AGEs可抑制AMPK信號(hào)和活化mTOR蛋白分子，阻斷下游ULK1復(fù)合物和PI3K復(fù)合物表達(dá)，介導(dǎo)足細(xì)胞自噬缺陷。高糖通過(guò)血管緊張素Ⅱ1型受體相關(guān)蛋白Apelin激活ERK/Akt/mTOR通路，抑制足細(xì)胞自噬，促進(jìn)了足細(xì)胞凋亡和DN進(jìn)展[15]。用雷帕霉素[11]、Sequestosome1基因敲除[16]等方法激活自噬，則能緩解高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷和胰島素抵抗，延緩DN進(jìn)展，可見(jiàn)足細(xì)胞自噬可能是DN治療的潛在靶點(diǎn)。

近端小管上皮細(xì)胞正常狀態(tài)下腎小管細(xì)胞基線自噬水平較低，其中與遠(yuǎn)端小管細(xì)胞比較，近端小管細(xì)胞自噬水平對(duì)腎功能的維護(hù)似乎更為重要。Atg5缺乏可導(dǎo)致自噬體形成障礙，Liu等[15]利用Atg5flox/flox小鼠分別與Pax8.rtTA;tetO.Cre和Ksp.Cre轉(zhuǎn)染小鼠雜交構(gòu)建了兩種不同的腎小管特異性Atg5基因敲除小鼠體系[17]，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端腎小管細(xì)胞Atg5缺失不會(huì)引起腎臟結(jié)構(gòu)和功能改變，而近端和遠(yuǎn)端腎小管同時(shí)缺失Atg5會(huì)造成小鼠血清Cr升高，腎臟超微結(jié)構(gòu)損害。因此，目前小管系統(tǒng)自噬研究多以集中在近端腎小管細(xì)胞。

在體外高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞(PTECs)、STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型和DN患者腎活檢標(biāo)本中均證實(shí)[18-19]，高糖可抑制PTECs自噬活力，可能參與了糖尿病狀態(tài)下腎臟結(jié)構(gòu)和功能損害。高糖或AGEs抑制了PTECs溶酶體生物合成功能，封閉近端小管細(xì)胞自噬流，進(jìn)而促進(jìn)了巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化相關(guān)因子激活，介導(dǎo)腎纖維化[20]。Zhao等[18]在人近端小管上皮細(xì)胞(HK2)中進(jìn)一步證實(shí)，AGEs高暴露通過(guò)降低溶酶體水解酶cathepsin B、cathepsin L和cathepsin D表達(dá)，抑制自噬溶酶體降解，加重了腎小管上皮細(xì)胞凋亡和間質(zhì)纖維化。從腎小球?yàn)V過(guò)的蛋白具有腎毒性作用，近端小管特異性Atg5敲除小鼠中蛋白尿誘導(dǎo)的小管損傷加重，表明自噬具有腎保護(hù)作用[8]。通過(guò)建立近端腎小管Atg5基因敲除小鼠或Atg5siRNA 轉(zhuǎn)染PTECs直接抑制自噬，能促進(jìn)小管細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，加重腎臟損傷[20]?？梢?jiàn)，維持一定量的自噬水平對(duì)保護(hù)小管細(xì)胞功能至關(guān)重要。mTOR激活和SIRT1沉默均參與了高糖誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞自噬缺陷，用mTOR抑制劑雷帕霉素激活自噬則能緩解高糖誘導(dǎo)的PTECs上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和脂質(zhì)蓄積，改善小管細(xì)胞功能[19]。Liu等[21]通過(guò)沉默Notch1信號(hào)蛋白，發(fā)現(xiàn)高糖通過(guò)抑制Notch1/Hes1/ PTEN信號(hào)通路，阻斷NRK-52e細(xì)胞自噬，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，加重腎纖維化進(jìn)展，而自噬抑制劑3MA和氯喹可加速EMT進(jìn)展[20,22]，增加糖尿病狀態(tài)下腎臟損害。

盡管上述研究均發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)近端小管細(xì)胞自噬缺陷，仍有少部分研究持不同意見(jiàn)。Zhao等[23]發(fā)現(xiàn)高糖促進(jìn)了HK2細(xì)胞自噬活性，表現(xiàn)為自噬標(biāo)志蛋白LC3-II過(guò)表達(dá)和電鏡下自噬體形成增加。Gou等[24]研究發(fā)現(xiàn)高糖可激活體外培養(yǎng)的HK2細(xì)胞自噬和凋亡水平，并具有時(shí)間依賴性，隨著高糖培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，自噬水平不斷提升。這兩項(xiàng)研究均未檢測(cè)自噬流下游自噬溶酶體降解標(biāo)志蛋白p62/SQSTM1，不能反映自噬流全貌。而自噬體降解功能障礙可引起損傷蛋白和氧化應(yīng)激蓄積，介導(dǎo)近端小管細(xì)胞損傷。

系膜細(xì)胞系膜區(qū)擴(kuò)張是DN典型病理改變之一。系膜細(xì)胞增生、肥大，導(dǎo)致系膜外基質(zhì)沉積(ECM)，最終引起腎小球硬化。自噬對(duì)維持系膜細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，高糖可阻斷系膜細(xì)胞自噬激活。體外培養(yǎng)的小鼠系膜細(xì)胞系SV40 MES 13中[25]，高糖誘導(dǎo)自噬標(biāo)志物Beclin 1和LC3 II低表達(dá)，自噬拮抗劑3-MA可通過(guò)抑制SIRT1通路，增加細(xì)胞α-SMA、FN和Col IV水平，促進(jìn)系膜細(xì)胞ECM蓄積和腎小球纖維化。組織抑制劑金屬蛋白酶3 (TIMP3)在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠和DN患者腎臟中表達(dá)降低，敲除TIMP3可導(dǎo)致FoxO1表達(dá)減少，Atg5、Becn1和LC3等Foxo1靶向自噬相關(guān)基因隨之下降，推斷TIMP3可通過(guò)調(diào)控自噬預(yù)防DN進(jìn)展。體外高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中進(jìn)一步證實(shí)，TIMP3缺失可致自噬相關(guān)基因表達(dá)減少，恢復(fù)TIMP3表達(dá)后可通過(guò)上調(diào)Foxo1表達(dá)激活自噬，改善糖尿病腎損害[26]。

然而，AGEs誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞自噬水平變化結(jié)果似乎并不一致。AGEs刺激大鼠系膜細(xì)胞HBZY-1的研究發(fā)現(xiàn)[27]，隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3I表達(dá)增加，p62/SQSTM1蛋白減少，電鏡顯示吞噬泡數(shù)量增多，ROS介導(dǎo)的ERK信號(hào)通路可能參與了這一自噬上調(diào)過(guò)程。用Beclin-1 siRNA或Bafilomycin A1抑制自噬后，細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積，證實(shí)自噬對(duì)AGEs誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞具有保護(hù)作用。另一項(xiàng)針對(duì)HBZY-1的研究表明[28]，系膜細(xì)胞自噬水平隨著AGEs誘導(dǎo)時(shí)間的增加而波動(dòng)，從加入AGEs到4h時(shí)，自噬水平達(dá)到頂峰，隨后不斷下降，電鏡提示自噬體形成增多，mTOR信號(hào)通路的抑制可能與HBZY-1自噬激活有關(guān)。上述兩項(xiàng)研究中，AGEs均能誘導(dǎo)系膜細(xì)胞自噬加強(qiáng)，增強(qiáng)的自噬幫助細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激，保護(hù)細(xì)胞功能。但當(dāng)超過(guò)細(xì)胞適應(yīng)性防御機(jī)制極限時(shí)，自噬水平下降，將反過(guò)來(lái)進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷。

內(nèi)皮細(xì)胞腎小球內(nèi)皮細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)的第一道屏障，直接暴露于血液循環(huán)，極易受到血液中多種致病因素?fù)p傷，與多種腎病的始動(dòng)密切相關(guān)。目前有關(guān)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞自噬的研究較少。在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞特異性Atg5敲除糖尿病小鼠電鏡下可見(jiàn)腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張、基膜增厚和足突增寬消失，同時(shí)伴有大量蛋白尿，表明內(nèi)皮細(xì)胞自噬能保護(hù)糖尿病狀態(tài)下腎小球?yàn)V過(guò)屏障，維護(hù)足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[12]。高糖降低了體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3I表達(dá)，阻礙自噬激活，進(jìn)而促進(jìn)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷，這一過(guò)程可能與高糖抑制CaMKKβ-LKB1-AMPK-eNOS通路有關(guān)[5]。Hou等[29]研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸A通過(guò)下調(diào)AGE-RAGE-Nox4信號(hào)通路，緩解腎小球內(nèi)皮細(xì)胞炎癥及氧化損傷，上調(diào)Sirt1-Foxo3a-Bnip3表達(dá)，激活內(nèi)皮細(xì)胞自噬，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。受限于內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)較難，有關(guān)自噬在內(nèi)皮細(xì)胞中的具體作用機(jī)制及其與糖尿病的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

小結(jié)：自噬在DN中的表達(dá)狀態(tài)目前尚存爭(zhēng)議，盡管多數(shù)研究證實(shí)糖尿病腎臟中存在自噬缺陷，但仍有部分研究持相反觀點(diǎn)。mTOR特異性敲除大鼠表現(xiàn)為蛋白尿產(chǎn)生和腎損傷的加重[30]，提示自噬過(guò)度激活絕非腎臟的保護(hù)因素。探尋保護(hù)性和損傷性自噬水平的平衡點(diǎn)，揭示自噬在DN中的具體作用機(jī)制和相關(guān)信號(hào)調(diào)控通路，從而為DN的防治提供新靶標(biāo)是未來(lái)研究的新方向。