燕國麗 胡作為 成薇婷

(武漢市第一醫(yī)院腫瘤科，武漢430000)

肺癌仍然是全球癌癥死亡的首要原因[1]，其是導致男性癌癥死亡的主要原因，也是女性癌癥死亡的第二大原因[2]。有研究顯示，相比于正常人群，miR-3168 在肺癌患者中表達上調(diào)[3]。但是miR-3168表達上調(diào)的原因和其導致的結果的分子機制目前尚無研究。已經(jīng)在多種人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)程序性細胞死亡因子5(Programmed cell death 5,PDCD5)的表達降低，例如乳腺癌、肝細胞癌、肺癌、胃癌、慢性髓性白血病、星形細胞膠質瘤、軟骨肉瘤、喉鱗狀細胞癌和卵巢癌[4]。最近的研究顯示腫瘤抑制因子PDCD5在p53介導的細胞凋亡中起積極作用[5]，當細胞DNA被破壞時，PDCD5與Tip60形成復合物，其從胞質溶膠轉移至細胞核，通過Lys-120處的p53乙?；龠MDNA損傷反應[6]。此外，PDCD5與BAX相互作用以介導細胞色素C釋放[4]。另一方面，PDCD5的抑制或敲低都會減弱癌細胞的凋亡[7]。盡管PDCD5明顯作為p53介導的細胞凋亡的正調(diào)節(jié)因子，但PDCD5在細胞凋亡過程中的調(diào)節(jié)方式尚不清楚?；诖?，本研究旨在探討miR-3168通過調(diào)節(jié)PDCD5對非小細胞肺癌A549細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 pmiR-RB-Report質粒購自廣州市銳博生物科技有限公司(貨號：GUR100013-P-2)。PDCD5、P21、BAK、P53、BCL-2、TUBULIN抗體購自Abcam公司(貨號：ab83958、ab109520、ab32371、ab32503、ab32124、ab210797)。H3抗體購自CST公司(貨號：4499)。A549細胞購自上海信裕生物科技有限公司(貨號：AD0202)。RPMI1640培養(yǎng)基購自GE health公司(貨號：SH30091)，胎牛血清購自Thermo Fisher Scientific公司(貨號：10099-133)。蛋白酶抑制劑Cocktail (不含EDTA,mini片劑) 購自Bimake公司(貨號：B14011)。Etoposide(ET)購自SELLECK公司(貨號：S1225)。PBS購自生工生物工程(上海)股份有限公司(貨號：E607008)。青鏈霉素混合液(×100)購自北京索萊寶科技有限公司(貨號：P1400)。ClonExpress Ⅱ One Step Cloning試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司(貨號：C112-01/02)。2×SDS 蛋白電泳上樣緩沖液購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司(貨號：WB-0081)。蛋白裂解液購自碧云天生物技術有限公司(貨號：P0013)。Xfect RNA Transfection Reagent購自TaKaRa公司(貨號：631318)。Luciferase熒光素酶報告檢測試劑盒購自艾美捷公司(貨號：K801-200)。miR-3168序列來自miRBase，miR-3168 mimics和miR-3168 inhibitor購自生工基因公司(貨號：HmiRQP1498,HmiRQP9001)。miRNA快速提取試劑盒購自HaiGene公司(貨號：B1802)。miRNA反轉錄和qPCR試劑盒購自復能基因公司(貨號：QP015)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和藥物處理 非小細胞肺癌細胞A549維持在含有100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10%熱滅活的FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，并在潮濕氣氛(37℃，5%CO2)中培養(yǎng)。 20 ng/ml的ETO處理A549細胞12 h后收獲細胞。

1.2.2細胞轉染 通過Xfect RNA Transfection Reagent轉染A549細胞。將WT/MT-3′UTR-PDCD5 的質?；騧iR-3168 mimics或miR-3168 inhibitor與轉染試劑混合，靜止大約20 min后，緩緩滴入A549細胞。

1.2.3免疫印跡 用冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌A549細胞并收集。用裂解緩沖液[50 mmol/L Tris-Cl(pH7.5)，150 mmol/L NaCl，1%NP40,10 mmol/L NaF，10 mmol/L焦磷酸鈉和蛋白酶抑制劑]制備細胞提取物并冰上孵育30 min。用8%SDS-PAGE凝膠分離目的蛋白質并轉移到硝酸纖維素膜上。通過在含有1× PBS和Tween-20(PBST)的5%w/v脫脂牛奶封閉緩沖液中孵育2 h來封閉膜。將封閉的膜在4℃下與指定的抗體一起溫育過夜。用1×PBST洗滌后，將膜與適當?shù)睦备^氧化物酶綴合的抗體一起溫育1 h。用ECL試劑顯影。

1.2.4RNA抽取與熒光定量PCR 根據(jù)試劑盒的說明書，用miRNA快速提取試劑盒和miRNA反轉錄和qPCR試劑盒進行miRNA分離，DNA以及qPCR反應。用每個基因的正向和反向引物進行實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)。將來自逆轉錄反應的1 μl cDNA加入到含有10 μl 2×SYBR?PremixEx TaqTM和0.2 μmol/L正向和反向引物的20 μl qRT-PCR混合物中。 PCR在ABI 7500實時PCR系統(tǒng)中進行。將樣品在95℃下孵育10 min，然后再95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，變性退火延伸總計30個循環(huán)，之后60℃孵育1 min，將所有樣品標準化為人U6并表達為倍數(shù)誘導。所有反應一式三份進行。使用比較方法計算相對表達水平和SD。

1.2.5Annexin V染色法 在Annexin V染色之前，將A549細胞置于37℃，5%CO2和1%O2的缺氧室中16～18 h;將A549細胞在低氧或含氧量正常的條件下培養(yǎng)2 h，然后在指定的氧條件下用1 μmol/L阿糖胞苷處理16～18 h。之后使用Annexin V染色，使用顯微鏡觀察細胞凋亡情況。

2 結果

2.1miR-3168靶向PDCD5的3′UTR 根據(jù)TargetScan生物軟件在線分析，發(fā)現(xiàn)miR-3168與PDCD5的3′UTR有一處高度匹配，處于108～114的位置，見圖1。

將miR-3168與PDCD5的3′UTR匹配區(qū)域做CUCCG的突變，將其與野生型PDCD5的3′UTR克隆進pmiR-RB-Report質粒中，見圖2。

共轉染miR-3168 mimics和WT-PDCD5-3′UTR或MT-PDCD5-3′UTR，利用luciferase report assay檢測雙熒光素酶活性。相比于對照組(共轉染negative control)，WT-PDCD5-3′UTR組的雙熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而MT-PDCD5-3′UTR無顯著差異(P>0.05)，見圖3。基于此，miR-3168靶向PDCD5的3′UTR。

圖1 miR-3168與PDCD5的3′UTR高度匹配Fig.1 miR-3168 is highly matched to PDCD5′s 3′UTR

圖2 克隆MT/WT-PDCD5-3′UTRFig.2 Clone MT/WT-PDCD5-3′UTR

圖3 共轉染miR-3168與未共轉染miR-3168的熒光素酶活性比較Fig.3 Comparison of luciferase activity between co-tran-sfected miR-3168 and unco-transfected miR-3168Note: *.P<0.05.

2.2過表達miR-3168時，PDCD5的表達量下降，細胞凋亡水平下降 由于PDCD5介導的細胞凋亡是為了抵抗DNA損傷[5]，因此用依托泊苷(Etoposi-de,ETO)處理細胞來模擬DNA損傷，且用Annexin-V染色來檢測A549細胞凋亡水平，見圖4。實驗發(fā)現(xiàn)用ETO處理細胞后，過表達miR-3168時，相比于對照組，A549細胞凋亡水平顯著降低(P<0.05)；而未用ETO處理細胞時，無論是否過表達miR-3168，細胞凋亡水平無明顯變化(P<0.05)。

圖4 ETO處理后轉染miR-3168 mimics與未轉染miR-3168 mimics的A549細胞凋亡水平比較Fig.4 Comparison of apoptosis levels of transfected miR-3168 mimics with A549 cells transfected with miR 3168-mimics after ETO treatmentNote: *.P<0.05.

圖5 過表達miR-3168轉染miR-3168 mimics與未轉染miR-3168 mimics的miR-3168表達量比較Fig.5 Expression of miR-3168 after transfection of miR-3168 mimicsNote: *.P<0.05.

轉染miR-3168 mimics后，用RT-qPCR檢測miR-3168的表達量，miR-3168表達量顯著升高(P<0.05)，見圖5。ETO處理細胞12 h后，相比于未轉染miR-3168 mimics的Control，PDCD5的表達量顯著下降(P<0.05)，細胞凋亡相關蛋白P21和BAK的蛋白表達量顯著下降(P<0.05)，而BCL-2的蛋白表達量顯著上升(P<0.05)，見圖6。

因為PDCD5通過P53入核介導細胞的凋亡來抵抗DNA損傷。因此，過表達miR-3168后用ETO處理A549細胞12 h， 抽取細胞的細胞質蛋白和細胞核蛋白，發(fā)現(xiàn)ETO未處理時，P53存在于細胞質中，而ETO處理后，P53進入了細胞核。而過表達miR-3168后，P53仍然能入核，但是入核的蛋白量明顯比對照組低(P<0.05)，見圖7。

圖6 PDCD5與相關凋亡標志蛋白的表達水平Fig.6 Expression levels of PDCD5 and related apopto-sis marker

圖7 過表達miR-3168時P53的入核情況Fig.7 Nuclear localization of P53 during overexpression of miR-3168

2.3敲低miR-3168時，PDCD5的表達量上升，細胞凋亡水平上升 由于PDCD5介導的細胞凋亡是為了抵抗DNA損傷[5]，因此用ETO處理細胞來模擬DNA損傷，且用Annexin-V染色來檢測A549細胞凋亡水平，見圖8。發(fā)現(xiàn)用ETO處理細胞后，敲低miR-3168時，相比于對照組，A549細胞凋亡水平顯著升高P<0.05)；而未用ETO處理細胞時，無論是否敲低miR-3168，細胞凋亡水平無明顯變化(P<0.05)。

轉染miR-3168 inhibitor后，用RT-qPCR檢測miR-3168的表達量，miR-3168表達量顯著降低(P<0.05)，見圖9。ETO處理細胞12 h后，相比于未轉染miR-3168 inhibitor的對照組，PDCD5的表達量顯著上升(P<0.05)，細胞凋亡相關蛋白P21和BAK的蛋白表達量顯著上升(P<0.05)，而BCL-2的蛋白表達量顯著下降(P<0.05)，見圖10。

圖8 ETO處理后轉染miR-3168 inhibitor與未轉染miR-3168 inhibitor的miR-3168表達量比較Fig.8 Comparison of miR-3168 expression in transfected miR-3168 inhibitor and untransfected miR-3168 inhibitor after ETO treatmentNote: *.P<0.05.

圖9 敲低miR-3168后，miR-3168的表達量Fig.9 Expression of miR-3168 after knockdown of miR-3168Note: *.P<0.05.

圖10 PDCD5與相關凋亡標志蛋白的表達水平Fig.10 Expression levels of PDCD5 and related apoptosis marker proteins

圖11 敲低miR-3168時P53的入核情況Fig.11 Nuclearization of P53 at miR-3168 during knockdown

因為PDCD5通過P53入核來介導細胞的凋亡來抵抗DNA損傷。因此，敲低miR-3168后用ETO處理A549細胞12 h，抽取細胞的細胞質蛋白和細胞核蛋白，發(fā)現(xiàn)敲低miR-3168后，P53入核的蛋白量明顯比對照組高(P<0.05)，見圖11。

3 討論

肺癌是中國癌癥死亡的主要原因[8]，是最危險的惡性腫瘤之一，其診斷后的5年生存率為15.6%，低于乳腺癌、結腸癌或前列腺癌的生存率[9]。它可以分為兩種：非小細胞肺癌和小細胞肺癌，分別約占肺癌病例的80%和20%[10]。但是，肺癌的發(fā)病機制非常復雜[11]，其中細胞凋亡相關基因表達異常是肺癌發(fā)生和發(fā)展的一個重要原因[12]。

相比于正常人群，miR-3168在肺癌患者中呈現(xiàn)一種高表達的狀態(tài)[3]。但是miR-3168的功能和相關分子機制目前尚無研究。在本研究中，通過TargetScan分析，發(fā)現(xiàn)miR-3168僅在一個區(qū)域與PDCD5具有較高匹配度。之后通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，野生型的PDCD5-3′UTR的報告基因活性在過表達miR-3168后明顯降低(P<0.05)，但是突變型的PDCD5-3′UTR報告基因活性在過表達miR-3168后無明顯變化(P<0.05)。因此，miR-3168靶向結合PDCD5的3端非編碼區(qū)。并且過表達miR-3168時，PDCD5的表達量明顯下降(P<0.05)。而轉染miR-3168 inhibitor進A549細胞時，PDCD5的表達量顯著上升(P<0.05)。

PDCD5被認為是促凋亡的分子[13]。Xu等[6]發(fā)現(xiàn)PDCD5可與Tip60相互作用并且抑制Tip60被蛋白酶體降解。在本研究中，過表達miR-3168造成PDCD5的表達量下降后，細胞凋亡相關蛋白P21和BAK的蛋白表達量顯著下降(P<0.05)，而BCL-2的蛋白表達量顯著上升(P<0.05)；而轉染miR-3168 inhibitor進A549細胞時，PDCD5的蛋白表達量顯著上升(P<0.05)，細胞凋亡相關蛋白P21和BAK的蛋白表達量顯著上升(P<0.05)。已發(fā)表的數(shù)據(jù)表明Tip60與p53相互作用并增加p53的穩(wěn)定性和乙?；絒6]。值得注意的是，K120位點上的乙?；莗53依賴性細胞凋亡的關鍵[14]，此位點乙?；蟮膒53通過調(diào)節(jié)凋亡基因的表達來調(diào)控細胞凋亡。有研究表明泛素E3連接酶DNAJB1使PDCD5不穩(wěn)定以抑制p53介導的細胞凋亡[15]。在本研究中，過表達miR-3168造成PDCD5的表達量下降后，P53入核受到抑制(P<0.05)；而轉染miR-3168 inhibitor進A549細胞時，促進P53入核(P<0.05)。基于此，我們推測PDCD5是p53的一個入核促進因子，當PDCD5缺失時，p53在K120位點上的乙酰化水平受到影響，p53的入核過程在抵抗DNA損傷時受到明顯的抑制。

綜上所述，miR-3168通過抑制PDCD5表達量來抑制非小細胞肺癌細胞A549的凋亡。