吳 琳

(浙江特殊教育職業(yè)學(xué)院，杭州310023)

牙周炎屬于臨床常見慢性口腔炎癥疾病，調(diào)查顯示，牙周炎發(fā)病率高達(dá)70%，若不及時(shí)治療則會(huì)發(fā)展為牙齦炎、牙槽骨吸收甚至牙齒脫落，嚴(yán)重影響患者日常生活[1]。煙草中含有尼古丁、乙醛及丙醛等多類有害物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)煙草中有害物質(zhì)可導(dǎo)致牙槽骨吸收，是引發(fā)牙周炎、種植體失敗的主要原因[2]。牙菌斑生物膜是導(dǎo)致牙周炎的重要起因，目前多數(shù)研究認(rèn)為牙周組織炎性反應(yīng)及免疫應(yīng)答與牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。Wang等[4]研究認(rèn)為輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17,Th17)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells,Treg)比例失衡所導(dǎo)致的自身免疫反應(yīng)是導(dǎo)致牙周炎發(fā)生的重要原因。然而煙草是否影響牙周炎所引發(fā)的免疫失衡，目前尚不明確。本研究通過制備牙周炎小鼠，給予煙草提取物(Cigarette smoke extraction,CSE)處理，以觀察CSE對牙周炎小鼠Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡的影響，以期為牙周炎的發(fā)病機(jī)制研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株以及動(dòng)物 P.gingivalis 菌株購于上海北諾生物科技有限公司，置于BHI血瓊脂培養(yǎng)基，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SPF級BALB/cJ小鼠，6周齡，60只，體重29～33 g,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK(豫)2017-0004。小鼠均在22～25℃室溫、50%～60%濕度、12 h光照、無致病菌環(huán)境中統(tǒng)一飼養(yǎng)，室內(nèi)保持通風(fēng)良好，小鼠自由飲水、攝食，飼養(yǎng)1周后用于模型制備。

1.1.2試劑與儀器 BHI固體、液體培養(yǎng)基、Ⅳ型膠原酶(Sigma,美國)；兔抗鼠白介素-17(Interleukins-17，IL-17)、視黃酸相關(guān)孤兒受體(Retinoid-related orphan receptors,RORγt)、IL-10、又頭框轉(zhuǎn)錄因子P3(Forkhead box P3,FoxP3)(Abcam，英國)；β-actin、山羊抗兔HRP標(biāo)記IgG抗體(CST，美國)；封閉液(Gibco，美國)；PVDF膜、亞甲基藍(lán)(索萊寶，中國北京)；蛋白提取試劑盒(Omega，美國)；BCA蛋白測定試劑盒(碧云天，上海)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(Azer Scientific，美國)；電泳儀與配套設(shè)備、凝膠成像儀(Biorad，美國)；光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯，日本)。

1.2方法

1.2.1模型制備[5]P.gingivalis菌株培養(yǎng)5 d后，置于BHI固體培養(yǎng)基，篩選單個(gè)菌落，純化菌株，置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，收集菌液，調(diào)整細(xì)菌密度為1×108CFU。小鼠制備前腹腔注射3 ml/kg 10% 水合氯醛進(jìn)行麻醉，采用4/0絲線繞牙頸部，于腭側(cè)打結(jié)，將絲線推入齦溝中，1周后，于小鼠牙齦內(nèi)接種制備好菌懸液，模型制備成功：小鼠牙周出現(xiàn)一定程度的炎癥，且伴有附著喪失，X射線檢測發(fā)現(xiàn)牙槽骨出現(xiàn)不同程度的吸收，牙齒松動(dòng)等。模型制備成功小鼠共48只。對照組小鼠絲線結(jié)扎牙頸部后，牙齦內(nèi)僅注射生理鹽水。

1.2.2CSE制備 帝豪牌香煙，每支含焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.0 mg，煙氣一氧化碳量13 mg，參照Chapman等[6]CSE制備法進(jìn)行制備，封閉濾嘴后，置于抽吸裝置內(nèi)點(diǎn)燃香煙，使煙霧均勻通過10 ml 生理鹽水，共吸取10只香煙，將煙霧水溶液過濾后收集CSE。此時(shí)CSE含量記為100%，添加生理鹽水分別稀釋至總含量的40%、20%、10%。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組與給藥 將模型小鼠隨機(jī)分為模型組(Model組)、CSE低、中、高劑量組(CSE-L、CSE-M、CSE-H)，另設(shè)置對照組(Control)，每組均12只小鼠。CSE各組小鼠在模型制備后于牙齦內(nèi)齦溝底部注射10%、20%、40% CSE，每天1次；Control、Model組于牙齦內(nèi)齦溝底部注射等量生理鹽水，每天1次。各組連續(xù)處理7 d。

1.2.4牙齦指數(shù)(Gingival index,GI)測定 小鼠麻醉后，采取仰臥位，用牙周探針探查小鼠牙齦情況，參照Lobene評定標(biāo)準(zhǔn)[7]從牙齦炎癥、顏色、水腫、出血等方面，對GI進(jìn)行評定。

1.2.5牙槽骨吸收評價(jià) 各組隨機(jī)選取6只小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠后，獲取上頜骨組織，將上頜骨在100℃沸水中處理5 min，剝離軟組織清洗后晾干，添加0.1%亞甲藍(lán)染色1 min，將上頜骨置于體視顯微鏡，測定第一磨牙到第三磨牙處釉牙骨質(zhì)界(Cemento-enamel junction,CEJ)到牙槽嵴頂(Alveolar bone crest,ABC)的距離。

2.1 3組麻醉蘇醒時(shí)間比較 A組、B組、C組麻醉蘇醒的平均時(shí)間分別為(7.60±2.51)min、(7.75±2.50)min及(8.98±2.53)min。A、B兩組的麻醉蘇醒時(shí)間明顯短于C組(F=3.6300，P=0.029 5；tAB=-0.3775,PAB>0.05；tAC=3.4726,PAC<0.05；tBC=3.0951，PBC<0.05)。

1.2.6HE染色觀察小鼠牙周組織變化情況 各組隨機(jī)選取6只小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠后，收集上頜骨組織，部分置于4%多聚甲醛中過夜固定標(biāo)本，修正標(biāo)本僅保留牙周組織，加入脫鈣液中處理6 d，添加醋酸鋰中和12 h，流水沖洗后置于梯度乙醇中脫水后，在二甲苯中脫蠟處理后，參照HE染色試劑盒對組織標(biāo)本進(jìn)行染色，置于顯微鏡下觀察牙周組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.2.7牙周組織中Th17、Treg細(xì)胞檢測 將1.2.6中另一部分上頜骨組織參照Kobayashi等[8]方法制備牙周組織單細(xì)胞懸液，將牙周組織剪為小塊，加入Ⅳ型膠原酶消化組織1 h，采用不銹鋼網(wǎng)過濾組織收集細(xì)胞原液，添加Ficoll分離液分離牙周組織單細(xì)胞，加入RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并調(diào)整為 5×105ml-1，添加20 μl FITC標(biāo)記兔抗小鼠CD3+、APC標(biāo)記兔抗小鼠CD4+抗體，避光孵育20 min，加入固定穿膜劑，避光孵育15 min，經(jīng)固定洗滌后，加入IL-17抗體，4℃孵育30 min，清洗后添加緩沖液，上機(jī)檢測。采用Cellsquest軟件分析檢測結(jié)果，以CD4+直方圖區(qū)分Th17細(xì)胞，以IL-17染色表示Th17，統(tǒng)計(jì)Th17細(xì)胞比例變化情況。

1.2.8牙周組織中Treg細(xì)胞檢測 收集牙周組織單細(xì)胞懸液，添加20 μl FITC標(biāo)記的兔抗小鼠CD4+、PE標(biāo)記兔抗小鼠CD25+抗體，避光孵育20 min，洗滌后，加入Foxp3抗體，4℃孵育25 min，清洗后添加緩沖液，上機(jī)檢測。采用Cellsquest軟件分析檢測結(jié)果，以CD25+直方圖區(qū)分Treg細(xì)胞，以Foxp3染色表示Treg，統(tǒng)計(jì)Treg細(xì)胞比例變化情況。

1.2.9Western blot檢測心肌中IL-17、RORγt、IL-10、Foxp3蛋白表達(dá) 牙周組織脫鈣處理后添加RIPA裂解液裂解組織，抽提總蛋白，取20 μg等量蛋白置于12%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜反應(yīng)后添加封閉液封閉2 h，添加IL-17、RORγt、IL-10、Foxp3、β-actin一抗稀釋液(1∶500)，4℃過夜孵育。洗滌后添加HRP標(biāo)記二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。ECL發(fā)光顯影后于光凝膠成像儀中成像，以β-actin為內(nèi)參蛋白，Image-plus系統(tǒng)分析IL-17、RORγt、IL-10、Foxp3表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1CSE對小鼠GI的影響 與Control組相比，Model組GI顯著升高(P<0.05)；與Model組相比，CSE各組GI均顯著升高(P<0.05)。見表1、2。

2.2CSE對小鼠牙槽骨吸收的影響 與Control組相比，Model組 CEJ到ABC距離顯著升高(P<0.05)；與Model組相比，CSE各組 CEJ到ABC距離均顯著升高(P<0.05)。見圖1。

Groups GIControl group0.23±0.02Model group1.13±0.191)CSE-L group1.44±0.162)CSE-M group1.76±0.122)CSE-H group1.93±0.142)

Note：Compared with Control group,1)P<0.05；compared with Model group,2)P<0.05.

2.3CSE對牙周組織病理形態(tài)學(xué)的影響 HE染色顯示，與Control組相比,Model組第二磨牙表面軟組織退縮，牙槽骨表面出現(xiàn)部分骨吸收,固有層伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤,膠原纖維排列紊亂、變性、斷裂。CSE各組第二磨牙牙周組織骨吸收程度增加、炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)量增多，隨著處理劑量的升高，牙周病變程度逐漸加重。見圖2。

2.4CSE對牙周組織Treg/Th17細(xì)胞比例的影響 與Control組相比，Model組 Th17細(xì)胞比例顯著升高，Treg細(xì)胞比例顯著降低，Th17/Treg比值顯著升高(P<0.05)；與Model組相比，CSE各組 Th17細(xì)胞比例顯著升高，Treg細(xì)胞比例顯著降低，Th17/Treg比值顯著升高(P<0.05)。見圖3，表3。

2.5CSE對牙周組織IL-17、RORγt、IL-10、Foxp3表達(dá)的影響 與Control組相比，Model組IL-17、RORγt蛋白表達(dá)升高，IL-10、Foxp3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與Model組相比，CSE各組IL-17、RORγt蛋白表達(dá)升高，IL-10、Foxp3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖4，表4。

Groups4 week(mm)Control group0.21±0.03Model group0.40±0.041)CSE-L group0.45±0.082)CSE-M group0.51±0.092)CSE-H group0.73±0.072)

Note：Compared with Control group,1)P<0.05；compared with Model group,2)P<0.05.

圖1 牙周組織亞甲基藍(lán)染色Fig.1 Methylene blue staining of periodontal tissue

圖2 HE染色觀察牙周組織形態(tài)學(xué)變化(×100)Fig.2 Observation of periodontal histomorphological changes by HE staining(×100)

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測牙周組織單細(xì)胞Th17、Treg細(xì)胞比例變化Fig.3 Flow cytometry was used to detect proportion of Th17 and Treg cells in periodontal tissue

GroupsProportion of Th17Proportion of TregTh17/Treg(×102)Control group0.12±0.025.06±0.252.34±0.51Model group0.22±0.031)6.13±0.371)3.64±0.421)CSE-L group0.31±0.022)7.27±0.342)4.57±0.362)CSE-M group0.36±0.042)8.04±0.762)4.89±0.642)CSE-H group0.44±0.082)8.87±0.482)5.26±0.722)

Note：Compared with Control group,1)P<0.05；compared with Model group,2)P<0.05.

圖4 WB檢測IL-17、RORγt、IL-10、Foxp3蛋白表達(dá)Fig.4 WB detection of IL-17,RORγt,IL-10,Foxp3 protein expressionNote: A.Control group;B.Model group;C.CSE-L group;D.CSE-M;E.CSE-H group.

圖5 免疫組化檢測IL-17、RORγt、IL-10、Foxp3蛋白陽性表達(dá)(×200)Fig.5 Immunohistochemical detection of positive expre-ssion of IL-17,RORγt,IL-10 and Foxp3 proteins(×200)

Groups IL-17RORγtIL-10Foxp3Control group0.32±0.060.16±0.030.92±0.060.95±0.11Model group0.44±0.081)0.21±0.061)0.78±0.071)0.78±0.061)CSE-L group0.62±0.092)0.30±0.092)0.54±0.062)0.63±0.032)CSE-M group0.81±0.082)0.36±0.072)0.42±0.092)0.58±0.062)CSE-H group1.04±0.152)0.41±0.052)0.29±0.042)0.38±0.172)

Note：Compared with Control group,1)P<0.05；compared with Model group,2)P<0.05.

Groups IL-17RORγtIL-10Foxp3Control group7.26±0.3812.21±0.4738.17±2.5626.95±2.26Model group13.64±1.091)20.45±1.151)28.36±2.161)19.29±2.131)CSE-L group20.31±2.132)24.42±2.232)19.59±1.562)12.63±1.662)CSE-M group23.45±1.482)28.33±2.162)14.43±1.852)10.26±1.452)CSE-H group26.63±1.362)30.24±4.392)12.32±2.112)9.44±1.172)

Note：Compared with Control group,1)P<0.05；compared with Model group,2)P<0.05.

2.6CSE對牙周組織IL-17、RORγt、IL-10、Foxp3蛋白陽性表達(dá)的影響 與Control組相比，Model組IL-17、RORγt蛋白陽性表達(dá)顯著升高，IL-10、Foxp3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與Model組相比，CSE各組IL-17、RORγt蛋白陽性表達(dá)顯著升高，IL-10、Foxp3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖5，表5。

3 討論

小鼠牙周組織與人相似，多數(shù)研究采用牙頸部結(jié)扎結(jié)合接種牙周炎致病菌復(fù)制牙周炎模型，顯示小鼠牙周組織病理表現(xiàn)與人牙周炎表現(xiàn)相似[9]。本研究結(jié)果顯示與Control組相比，Model組GI升高、CEJ到ABC距離升高，病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)Model組第二磨牙表面軟組織退縮，牙槽骨表面出現(xiàn)部分骨吸收，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤，膠原纖維排列紊亂、變性、斷裂，提示牙周組織出現(xiàn)明顯炎性反應(yīng)以及牙槽骨吸收，符合牙周炎小鼠模型基本特征[10]，提示牙周炎模型小鼠制備成功。

尼古丁為CSE中的生物堿成分，Mikiko等[11]研究發(fā)現(xiàn)尼古丁可通過降低牙齦中免疫細(xì)胞數(shù)量，降低機(jī)體防御功能，引發(fā)牙齦血管痙攣，造成牙周病。臨床研究發(fā)現(xiàn)停止吸煙患者微循環(huán)功能恢復(fù)正常，牙周炎性反應(yīng)顯著降低[12]。以上研究均表明煙草能夠損傷牙周組織引發(fā)牙周炎。本研究發(fā)現(xiàn)與Model組相比，CSE處理后各組GI、CEJ到ABC距離進(jìn)一步升高，病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)CSE各組牙槽骨骨吸收以及炎癥細(xì)胞浸潤程度加重，提示CSE可加重牙周炎小鼠病情進(jìn)展，然而具體作用機(jī)制，目前尚不清楚。CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在牙周炎獲得性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用。CD4+T細(xì)胞主要分化為Th1、Th2、Th17、Treg T細(xì)胞，通過作用于靶細(xì)胞后介導(dǎo)炎性反應(yīng)，破壞牙周組織。以往多數(shù)研究認(rèn)為,牙周炎的發(fā)生中Th1/Th2細(xì)胞免疫應(yīng)占有主導(dǎo)作用[13]。最新證據(jù)顯示Th17/Treg細(xì)胞比例的失衡與牙周炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14]。因此探究CSE對牙周組織中Th17/Treg細(xì)胞的作用，對于探究CSE破壞牙周組織機(jī)理十分重要。

Th17細(xì)胞屬于新型T細(xì)胞亞群，其能夠分泌IL-17A，進(jìn)一步提高IL-6水平，激發(fā)T細(xì)胞增殖，擴(kuò)大炎性反應(yīng)，進(jìn)而激活STAT信號通路，誘導(dǎo)RORγt蛋白表達(dá)促進(jìn)Th17細(xì)胞分化[15]。de Aquino等研究發(fā)現(xiàn)IL-17水平升高與牙周炎嚴(yán)重程度相關(guān)[16]。IL-17與牙周組織損傷程度有關(guān)，其表達(dá)升高能夠激活髓過氧化物酶、中性粒細(xì)胞蛋白酶活性，促進(jìn)趨化因子的分泌，加速局部炎性反應(yīng)[17]。Behfarnia等[18]研究發(fā)現(xiàn)牙周炎患者血清中Th17轉(zhuǎn)錄因子RORγt以及細(xì)胞因子IL-17水平顯著高于健康者，而IL-17引發(fā)炎性反應(yīng)可進(jìn)一步刺激Th17細(xì)胞分泌更多炎癥因子，進(jìn)一步加重牙周組織炎癥反應(yīng)。本研究檢測每組6只小鼠牙周組織Th17細(xì)胞比例變化，結(jié)果顯示Model組牙周組織中Th17細(xì)胞比例顯著升高，且其轉(zhuǎn)錄因子RORγt與分泌因子IL-17蛋白表達(dá)顯著升高，經(jīng)CSE干預(yù)后，牙周組織中Th17細(xì)胞比例、RORγt、IL-17蛋白表達(dá)進(jìn)一步顯著升高，表明在牙周炎的發(fā)展中，Th17細(xì)胞不斷分泌RORγt、IL-17作用牙周組織，加重牙周組織炎性反應(yīng)，提示CSE可能通過調(diào)控Th17細(xì)胞加重牙周組織炎性反應(yīng)。

Treg細(xì)胞屬于CD4+T細(xì)胞亞群之一，主要通過抑制自身免疫、調(diào)控免疫應(yīng)答來降低炎性反應(yīng)，F(xiàn)oxP3為其特異轉(zhuǎn)錄因子，IL-10為其主要分泌因子。Parachuru等[19]研究顯示牙周組織中FoxP3、IL-10蛋白表達(dá)明顯高于健康對照組，表明Treg細(xì)胞可能是通過分泌FoxP3、IL-10參與牙周炎的發(fā)生。 Dong等[20]通過給予牙周炎小鼠注射GITR抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牙周組織Treg細(xì)胞活性明顯降低，且組織中FoxP3、IL-10表達(dá)顯著降低,而γ-干擾素、TNF-α mRNA表達(dá)顯著升高，小鼠的牙槽骨缺損加重。Glowacki等[21]通過給予牙周炎小鼠局部注射CCL22誘導(dǎo)Treg細(xì)胞活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞活性顯著升高，且小鼠牙周炎炎癥程度明顯降低，牙槽骨的吸收也減少。本研究對每組的6只小鼠牙周組織同時(shí)進(jìn)行Treg細(xì)胞比例檢測，結(jié)果顯示Model組牙周組織中Treg細(xì)胞比例顯著降低，F(xiàn)oxP3、IL-10蛋白表達(dá)顯著降低，經(jīng)CSE干預(yù)后，牙周組織中Treg細(xì)胞比例、FoxP3、IL-10蛋白表達(dá)進(jìn)一步顯著降低，提示CSE可能通過抑制Treg細(xì)胞活性，進(jìn)而抑制FoxP3、IL-10表達(dá)，加重牙周組織炎性反應(yīng)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)CSE干預(yù)后，牙周組織中Th17/Treg細(xì)胞比例比值顯著升高，表明牙周組織Th17/Treg細(xì)胞平衡破壞，免疫抑制作用減弱，牙周組織朝向炎性反應(yīng)方向發(fā)展，提示CSE可通過破壞Th17/Treg細(xì)胞平衡加重牙周組織炎性反應(yīng)。

綜上所述，CSE可加重牙周炎病情程度，其可能是通過破壞牙周組織Th17/Treg細(xì)胞平衡，引發(fā)自身免疫反應(yīng)，進(jìn)而加重牙周組織炎癥反應(yīng)。然而牙周炎的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制較為復(fù)雜，本研究僅以小鼠為研究對象進(jìn)行研究，而CSE是否在人牙周組織中發(fā)揮同樣的作用，這還有待后期深入探究。