薛亞軍 杜雅彥 黃文華 耿 濤 魏育濤 胡建明

(新疆石河子大學醫(yī)學院，石河子832000)

食管癌居世界癌癥死亡病因的第6位，我國食管癌發(fā)病率和死亡病例均占全球的50%和發(fā)展中國家的60%，是居民的重要疾病負擔，侵襲和轉移是導致患者治療失敗和死亡的主要原因[1]。針對食管癌侵襲轉移的途徑進行研究，抑制食管癌的侵襲轉移是提高食管癌生存期的關鍵[2]。微小RNA(miRNAs)是一類在生物體內普遍存在的單鏈非編碼蛋白質小分子RNA，主要功能是調控生物體生長、發(fā)育、分化和凋亡等生命過程中的相關基因表達，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。miR-143-3p是高度保守的miRNA，位于人5號染色體33位，是腫瘤生長的潛在調控因子，異常表達與子宮內膜癌、卵巢癌、膀胱癌、大腸癌等多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關，但其在食管癌增殖、遷移和侵襲中的作用尚未見報道[4,5]。本研究通過采用將miRNA-143-3p擬似物和阻遏物轉染食管癌ECA109細胞，探討miRNA-143-3p對食管癌ECA109細胞增殖、遷移、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株和實驗動物 人食管癌ECA109細胞株由本院腫瘤研究中心提供，采用含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)液。SPF級BALB/c裸鼠36只，3～4周齡，體質量14～17 g，購于山東大學實驗動物中心，恒溫、恒濕飼養(yǎng)，采用隨機數(shù)字表法將動物分為4組即空白組、陰性組、擬似組和阻遏組。

1.1.2試劑與儀器 胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自北京義翹神州科技有限公司；Trizol購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；反轉錄試劑盒購自北京智杰方遠科技有限公司；MTT、Transwell小室購自上海子起生物科技有限公司；細胞培養(yǎng)箱購自廣州科適特科學儀器有限公司；RT-PCR試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；分光光度計購自托摩根生物科技有限公司；酶標儀購自香港伯齊科技有限公司；PCR儀購自杭州厚澤生物科技有限公司；miRNA-143-3p擬似物、阻遏物、陰性對照物的合成、測序均由大連寶公司進行。

1.2方法

1.2.1細胞轉染 取對數(shù)生長期的ECA109細胞，胰酶消化后1 000 g離心2 min，收集細胞，調整細胞密度至1×105個/ml，接種至6孔細胞培養(yǎng)板，每孔添加2 ml細胞懸液，37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，共分為4組，即空白對照組(Blank control group，空白組)只轉染試劑，陰性組轉染miRNA-143-3p陰性對照物，miRNA-143-3p擬似組轉染miRNA-143-3p擬似物，miRNA-143-3p阻遏組轉染miRNA145阻遏物，轉染過程按照Lipofectamine 2000說明進行。

1.2.2RT轉染后細胞內miRNA-143-3p表達檢測 轉染12、24、48、72 h后取細胞樣本，采用6孔板接種密度2×105個/孔，酚氯仿法抽取RNA，取2 μg總RNA，反轉錄制備cDNA，取2 μl反轉錄產物作為PCR反應模板，熒光定量法檢測miRNA-145含量，反應條件：95℃變性10 s，58℃退火10 s，72℃延伸10 s，循環(huán)數(shù)設置為40。miR-143-3p的上下游引物序列分別為5′-GGGGTGAGATGAAGCACTG-3′及5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。

1.2.3不同組別細胞裸鼠成瘤能力和免疫組化實驗檢測 細胞轉染后，給相應分組的裸鼠注射細胞，隔2 d檢測裸鼠成瘤情況，記錄腫瘤體積和質量；14 d 后處死實驗動物，采用免疫組化法檢測腫瘤中MAPK7表達情況，鏡下觀察顯色情況并拍照記錄。

1.2.4ECA109細胞株增殖活性檢測 轉染后48 h，胰酶消化法制備ECA109細胞懸液轉移至96孔板中，每孔含1×104個/ml，每組設6個復孔，接種后24、48、72 h每孔加入20 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，加入100 μl二甲基亞砜(Dimethyl sulphoxide,DMSO)溶解沉淀，震動混勻沉淀15 min，酶標儀比色，記錄490 nm處吸光度值。

1.2.5Transwell小室法檢測ECA109細胞株侵襲 取轉染后ECA109細胞株1×105ml-1，接種于Transwell板上室，每孔160 μl，加入20%五味子多糖(Alkaline S.chinensis polysaccharides,ASPS)血清40 μl，800 μl RPMI1640培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)24 h，計數(shù)基底膜下室細胞數(shù)，采用在400×顯微鏡下隨機選取中央和上下左右5個視野的穿越基底膜細胞數(shù)，取均值。

2 結果

2.1轉染后細胞內miRNA-143-3p表達 12、24、48、72 h時空白組和陰性組細胞內miRNA-143-3p表達相比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，均低于阻遏組，高于擬似組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2miRNA-143-3p轉染對ECA109細胞增殖的影響 空白組和陰性組24、48、72 h時ECA109細胞增殖水平相比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，均高于擬似組，低于阻遏組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白組和陰性組ECA109細胞侵襲能力相比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，均高于擬似組，低于阻遏組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 轉染后ECA109細胞內miRNA-143-3p表達Fig.1 Expression of miRNA-143-3p in ECA109 cells after transfectionNote: *.P<0.05.

圖2 miRNA-143-3p轉染對ECA109細胞增殖和侵襲能力的影響

Fig.2 Effect of miRNA-143-3p transfection on prolife-ration and invasion of ECA109 cells

Note: *.P<0.05.

圖3 4組裸鼠瘤體大小變化情況

Fig.3 Changes of tumor size in 4 groups of nude mice

Note: *.P<0.05.

圖4 4組裸鼠瘤組織MAPK7蛋白表達情況Fig.4 Expression of MAPK7 protein in 4 groups of nude miceNote: *.P<0.05.

2.34組裸鼠瘤體大小變化情況 空白組和陰性組裸鼠瘤重量均高于擬似組，低于阻遏組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，空白組和陰性組裸鼠瘤重量相比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.44組裸鼠瘤組織MAPK7蛋白表達情況 空白組和陰性組裸鼠瘤組織MAPK7蛋白表達水平相比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，均高于擬似組，低于阻遏組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

miRNA為非編碼的長約23個核苷酸的內源性微小RNA，可通過與靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)的序列互補降低mRNA的穩(wěn)定性和抑制其翻譯，調節(jié)靶基因表達。研究顯示，miRNA僅占人體基因組的1%～3%，但可調節(jié)30%的人類蛋白質編碼[6,7]。miRNA對編碼蛋白質基因的表達具有廣泛影響，并主要通過靶向mRNA 3′非翻譯端，負性調控靶mRNA的轉錄和翻譯，發(fā)揮類似于癌基因或抑癌基因的作用，在腎癌、結腸癌、肺癌、胃癌等腫瘤中均存在miRNA表達[8-11]。

近年來，越來越多的研究顯示miRNA表達異常參與了EC的發(fā)生發(fā)展。Guo等[12]在研究食管鱗癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)中miRNA表達譜時發(fā)現(xiàn) miR-25、miR-424、miR-151表達上調，miR-100、miR-99a、miR-29c、miR-140表達下調，這些表達異常的miRNA能夠準確區(qū)分ESCC和正常組織，進一步對miRNA表達譜與EC臨床病理資料進行分析時發(fā)現(xiàn)，miR-25、miR-130b與EC的高中低分化有關。趙曉鴻等[13]利用miRNA芯片技術檢測了ESCC組織中miRNA表達譜的變化，顯示has-miR-25、has-miR-424和has-miR-151在癌組織中上調，miR-133a、miR-143、miR-145與miR-375在癌組織中下調，可能與食管黏膜上皮的癌變相關，且其改變是ESCC發(fā)生的早期事件。Liu等[14]研究顯示miR-143和miR-145可調節(jié)FSCN1而致癌，并參與轉移的調節(jié)，可能為EC早期診斷和預后的潛在生物標志物。Wu 等[15]檢測 86 例ESCC標本中miRNAs 的表達，發(fā)現(xiàn)miR-143和miR-145的表達水平顯著下調，并與腫瘤的浸潤深度有關，轉染miR-145、miR-133a和miR-133b抑制EC細胞增殖和浸潤。Akagi等[16]的研究證明了 miR-145 和 miR-143 的高表達與ESCC的復發(fā)轉移有關。Kano等[17]的報告則證明了miR-145 的表達與ESCC的復發(fā)相關，并與患者的生存時間呈負相關。本研究將miRNA-143-3p擬似物和阻遏物轉染至食管癌ECA109細胞株，結果顯示，轉染miRNA-143-3p擬似物的細胞株增殖、侵襲能力均顯著降低，轉染miRNA-143-3p阻遏組細胞株增殖、侵襲能力均顯著增高，因此miRNA的表達特征對于研究能夠識別EC的存在、侵襲和預后的腫瘤標記物具有潛在的臨床應用價值，miR-143下調與食管癌的增殖、侵襲和預后密切相關，但其作用機制尚有待進一步研究探討。

信號傳導通路異常貫穿于惡性腫瘤的增殖、分化、凋亡等各個階段，絲裂酶原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)是細胞內絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包括5條并行MAPK信號通路，分別為ERK1/ERK2、JNK/SAPK、p38、ERK3/ERK4和ERK5，ERK5又稱為MAPK7，在腫瘤細胞的存活和生長過程中發(fā)揮重要作用[18]。MAPK7是非典型的MAPK通路，人類MAPK7是由816個氨基酸構成的120 kU蛋白，可通過磷酸化和C端的物理性結合作用激活轉錄因子肌細胞增強因子2A(Myameba enhancement factor2A，MEF2A)、肌細胞特異性增強因子2D(Myocyte enhancement factor 2D,MEF2D)和肌細胞特異性增強因子2C(Myocyte enhancement factor 2C,MEF2C)，引起c-jun、BMK1等基因表達增加,在細胞分化、凋亡、應激反應及多種疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[19]。研究顯示，MAPK7介導的信號對前列腺癌轉移癌模型具有明顯促進作用[20-22]。在乳腺癌模型中，MAPK7可介導乳腺腫瘤激酶激活，促進乳腺癌細胞轉移；肝癌中MAPK7的過度表達可促進有絲分裂和肝癌細胞生長。李進科等[23]對64例食管鱗狀細胞癌組織采用免疫組化方法檢測食管癌和癌旁組織中MAPK7表達，發(fā)現(xiàn)MPAK7在食管癌組織中表達顯著升高，且表達量與淋巴結轉移和臨床分期密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)轉染miRNA-143-3p擬似物的瘤體積顯著降低，MAPK7表達升高，轉染miRNA-143-3p阻遏物的瘤質量體積則顯著降低，MAPK7表達降低，提示miRNA-143-3p可能通過MAPK7途徑影響食管癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miRNA-143-3p表達異常是影響食管癌增殖侵襲的重要因素，MAPK7信號通路可能是其發(fā)揮作用的重要途徑，詳細機制尚有待進一步研究探討。