李 薇 ，劉振興，楊 萌，趙 爽，刁愛坡

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010110)

轉(zhuǎn)錄因子EB(Transcription Factor EB，TFEB)是第一個鑒定出的MiTF/TFE 家族的基本螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈(basic-helix-loop-helix leucine zipper，bHLH-Zip)類轉(zhuǎn)錄因子[1].TFEB 的細(xì)胞定位和活性調(diào)節(jié)與其磷酸化修飾狀態(tài)相關(guān).TFEB 蛋白至少可以在20 個位點(diǎn)被磷酸化[2-3]，其中的Ser142 和Ser211這兩個絲氨酸殘基對其亞細(xì)胞的定位具有關(guān)鍵作用[4-7].當(dāng)這兩個絲氨酸殘基都被磷酸化時，TFEB 定位在細(xì)胞質(zhì)中且無轉(zhuǎn)錄活性.TFEB 的活性嚴(yán)格地受到翻譯后修飾、蛋白質(zhì)間相互作用和空間組織的調(diào)控.在營養(yǎng)豐富的條件下，TFEB 主要以無活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)，但在饑餓或溶酶體功能發(fā)生障礙的條件下，TFEB 迅速轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核并激活其靶基因的轉(zhuǎn)錄[4,8].研究[9]表明，很多構(gòu)成溶酶體的蛋白表達(dá)由TFEB 調(diào)控.溶酶體功能正常是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的必要條件[10]，參與內(nèi)吞作用、自噬和溶酶體胞吐作用等許多基本的細(xì)胞過程[11].表達(dá)溶酶體蛋白增強(qiáng)溶酶體活性，如增強(qiáng)細(xì)胞自噬功能，可以防止溶酶體相關(guān)疾病的發(fā)生.TFEB 的失調(diào)會導(dǎo)致多種類型的癌癥，腫瘤細(xì)胞依賴于有效的溶酶體功能，并且在致癌過程期間發(fā)生溶酶體組成和數(shù)量的多種改變.腎細(xì)胞癌(RCC)是由腎小管上皮產(chǎn)生的異質(zhì)性腫瘤，其中的易位RCC(t-RCC)就是由MiTF/TFE 家族成員TFE3 和低頻率的TFEB 有關(guān)的基因融合引起的[12-13].在人類胰腺癌細(xì)胞(PANC1)中發(fā)現(xiàn)了TFEB 的非典型核定位[14].最近在非整倍體細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，TFEB激活是對未降解的自噬物的溶酶體積累后的溶酶體應(yīng)激的細(xì)胞應(yīng)答[15].

TFEB 在對細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中起作用，在細(xì)胞適應(yīng)各種內(nèi)部壓力和環(huán)境波動中的作用與其全面調(diào)節(jié)自噬/溶酶體系統(tǒng)的獨(dú)特能力密切相關(guān).TFEB 控制參與調(diào)節(jié)自噬、線粒體功能、代謝、未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)、凋亡和炎癥反應(yīng)關(guān)鍵基因的表達(dá)，具有廣泛的功能[16].此外，TFEB 的功能可能具有細(xì)胞類型的特異性，它的激活對于肝細(xì)胞中的脂質(zhì)分解代謝、巨噬細(xì)胞中的免疫應(yīng)答以及肌肉中有效的線粒體功能發(fā)揮重要作用.

但到目前為止，發(fā)現(xiàn)的具有誘導(dǎo)TFEB 發(fā)揮功能的化學(xué)藥物數(shù)量較少，而對于可以利用TFEB 作為靶點(diǎn)的治療腫瘤疾病和神經(jīng)退行性疾病等頑疾的藥物鮮有報道.本研究的目的在于構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TFEBGFP 的人子宮頸癌細(xì)胞HeLa，采用該細(xì)胞模型篩選新的促進(jìn)TFEB 入核并發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄功能的小分子化合物，并研究其對TFEB 的誘導(dǎo)作用及對細(xì)胞生長的影響.本研究將為以TFEB 為靶點(diǎn)調(diào)控溶酶體功能的藥物發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用提供理論和實(shí)物基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、細(xì)胞及質(zhì)粒

大腸桿菌(E.coli)STBL3、人胚腎細(xì)胞HEK293T、人子宮頸癌細(xì)胞HeLa、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231、穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3 的HeLa 細(xì)胞，慢病毒表達(dá)載體系統(tǒng)包括 pLVX-AcGFP1-N1、pMD2.G 和psPAX2 質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.1.2 主要試劑

Pfu DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶 EcoR Ⅰ和 BamH Ⅰ、DNA marker、蛋白預(yù)染marker、TurboFect?，Thermo 公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒，上海生工生物工程有限公司；胎牛血清(FBS)，浙江天杭生物科技有限公司；胰酶、DMEM 高糖培養(yǎng)基、嘌呤霉素、DAPI、LC3 抗體，美國Sigma 公司；Opti-MEM 培養(yǎng)基，美國Gibco 公司；噻唑藍(lán)(MTT)，北京索萊寶生物科技有限公司；βactin 抗體、TFEB 抗體，Santa 公司；p62 抗體，CST公司；Cathepsin B 抗體，Abcam 公司；Histone 抗體、GFP 抗體、HRP 標(biāo)記的鼠二抗、兔二抗，天津三箭生物技術(shù)有限公司.引物合成和基因測序由北京華大基因公司完成.

1.2 方法

1.2.1 pLVX-AcGFP1-N1-TFEB 表達(dá)載體的構(gòu)建

應(yīng)用Primer 5.0 軟件，根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中的人TFEB 基因序列設(shè)計(jì)引物.通過比對序列，選擇兩端加上EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線部分)及保護(hù)堿基.引物序列上游為 5'-CGGAATTCTGATG GCGTCACGCATAGGGTTGC-3'，下游為 5'-CGGG ATCCCGCAGCACATCGCCCTCCTCCATG-3'.以本實(shí)驗(yàn)室保存的pcDNA3.1+-flag-TFEB-HA 重組質(zhì)粒為模板，PCR 反應(yīng)體系：上、下游引物(10μmol/L)各2μL、模板cDNA 1μL、10×Pfu Buffer(with MgSO4)10μL、dNTP Mix(10 mmol/ L)2μL、Pfu DNA 聚合酶(2.5 U/μL)1μL、ddH2O 82μL.反 應(yīng) 條 件：95 ℃2 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，共30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min.擴(kuò)增得到TFEB 基因片段.將純化后的目的基因片段與 pLVX-AcGFP1-N1 載體采用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后純化回收，T4 DNA 連接酶于16 ℃連接過夜.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化STBL3 感受態(tài)細(xì)胞.隨機(jī)挑取大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，接種到5 mL 含有200μg/mL 氨芐霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)12～16 h.提質(zhì)粒后采用Taq DNA 聚合酶系統(tǒng)進(jìn)行PCR 驗(yàn)證.同時采用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證.分別取5μL PCR 產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠(0.8%)電泳檢測.選取經(jīng)酶切和PCR 驗(yàn)證都正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293T、HeLa、MDA-MB231 細(xì)胞均用含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液傳代.

1.2.3 慢病毒包裝

在60 mm 培養(yǎng)皿中接種適量HEK293T 細(xì)胞，細(xì)胞生長24 h 融合度達(dá)70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染.用TurbofectTM將pLVX-AcGFP1-N1-TFEB 重組質(zhì)粒及pLVX-AcGFP1-N1 質(zhì)粒分別與psPAX2、pMD2.G 兩個包裝質(zhì)粒按照4∶3∶1 的比例(共加入6μg)轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞.轉(zhuǎn)染12 h 更換新鮮培養(yǎng)基，再分別于24 h 和48 h 吸取上清液，將兩次收集液合并，分別為實(shí)驗(yàn)組病毒收集液及對照組病毒收集液，1 500 r/min 離心15 min，小管分裝，每管500 μL，-80 ℃避光保存.

1.2.4 HeLa 細(xì)胞最佳嘌呤霉素篩選濃度的確定

在96 孔板中接種適量HeLa 細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h 細(xì)胞長至70%～80%融合度時，更換含有不同濃度嘌呤霉素的培養(yǎng)基，設(shè)置嘌呤霉素終質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4μg/mL，每天鏡下觀察，并隔天更換含有不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基.3～5 d 后，導(dǎo)致細(xì)胞全部死亡的嘌呤霉素最低濃度即為最低致死濃度(一般以4 d 完全致死為準(zhǔn)).

1.2.5 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TFEB-GFP 的HeLa 細(xì)胞系

在35 mm 培養(yǎng)皿中接種適量HeLa 細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h 細(xì)胞長至70%～80%融合度時，更換含有8 μg/mL 聚凝胺(polybrene)的新鮮培養(yǎng)基；再分別加入500 μL 實(shí)驗(yàn)組病毒收集液和對照組病毒收集液，溫和地混勻，37 ℃、5% CO2條件下避光侵染24 h；更換含有最佳嘌呤霉素篩選濃度(終質(zhì)量濃度1μg/mL)的新鮮培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)5 d 后，計(jì)數(shù)并重新鋪細(xì)胞至60 mm 培養(yǎng)皿，一般每個培養(yǎng)皿700～800 個細(xì)胞，一直用含有1μg/mL 嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng).待單克隆長至肉眼可見時，將單克隆挑起并轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿擴(kuò)大培養(yǎng)獲得穩(wěn)定細(xì)胞系.熒光顯微鏡下拍照觀察，同時收集細(xì)胞，蛋白免疫印跡技術(shù)檢測成功表達(dá)TFEB-GFP 的細(xì)胞系.

1.2.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)

收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，加入適量RIPA 細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-Cl(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA(pH 8.0)，1% TritonX-100，0.1%SDS)(含蛋白酶抑制劑)在冰上裂解30 min，4 ℃離心收集上清液并按比例加入SDS 上樣緩沖液，經(jīng)10%SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用含有5%脫脂奶粉的PBST 緩沖液(膜封閉液)室溫封閉1 h，于4 ℃條件下進(jìn)行一抗(稀釋比例分別為TFEB 1∶200、β-actin 1∶5 000、Histone 1∶1 000、p62 1∶1 000、Cathepsin B 1∶2 000、LC3 1∶5 000、GFP 1∶1 000)孵育過夜，PBST 洗膜后再與二抗孵育2 h，PVDF 膜在MiniChemiTM迷你型化學(xué)發(fā)光成像儀下曝光成像.

1.2.7 藥物篩選

待60 mm 培養(yǎng)皿中TFEB-GFP 穩(wěn)定細(xì)胞系長至所需密度時即可進(jìn)行96 孔板鋪板.收集細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度，鋪板使待測細(xì)胞密度8 000 個/孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后加入終濃度為5μmol/L 的藥物處理，24 h 時用熒光顯微鏡拍照觀察.

1.2.8 MTT 法檢測細(xì)胞活力

收集對數(shù)期HeLa、MDA-MB231 細(xì)胞接種于96孔板中，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度，鋪板使待測細(xì)胞密度5 000 個/孔，設(shè)復(fù)孔3 個.常規(guī)培養(yǎng)24 h 后加入不同濃度的藥物處理(1、2.5、5、10、15、20μmol/L)，DMSO 為對照組.分別檢測24、48、72 h 的細(xì)胞活力.每孔加入20μL 5 mg/mL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入200μL DMSO 溶解沉淀，置水平搖床上振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解.利用酶標(biāo)儀檢測490 nm 波長下各孔的吸光度.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，*、**和***分別表示P＜0.05、P＜0.01 和P＜0.001.

2 結(jié)果與分析

2.1 pLVX-AcGFP1-N1-TFEB表達(dá)載體的構(gòu)建

pLVX-AcGFP1-N1-TFEB 表達(dá)載體的構(gòu)建如圖1所示.對以pcDNA3.1+-flag-TFEB-HA 質(zhì)粒為模板的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見大小約為1.5 kbp 的特異性PCR 擴(kuò)增條帶，與預(yù)期一致(圖 1(a)).將純化后的目的片段與載體 pLVXAcGFP1-N1 進(jìn)行雙酶切純化后連接，轉(zhuǎn)化 E.coli STBL3 宿主菌，挑取陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)，提質(zhì)粒后進(jìn)行PCR 及雙酶切驗(yàn)證，PCR 產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：PCR 擴(kuò)增出目的條帶大小與TFEB 基因(1.5 kbp)相符(圖1(b))；雙酶切重組質(zhì)粒2 出現(xiàn)的兩條帶的大小分別與TFEB 基因(1.5 kbp)和pLVX-AcGFP1-N1 載體(8.8 kbp)大小相符(圖1(c)).選取電泳條帶位置正確的重組質(zhì)粒2進(jìn)行測序，驗(yàn)證載體上插入的TFEB cDNA 序列方向、位置及大小均正確，表明 pLVX-AcGFP1-N1-TFEB 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功.

(a)中M.DNA marker；1.PCR 產(chǎn)物.(b)中M.DNA marker；1—2.重組質(zhì)粒PCR 產(chǎn)物；P.陽性對照；N.陰性對照.(c)中M.DNA marker；1—2.重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物

2.2 穩(wěn)定表達(dá)TFEB-GFP HeLa 細(xì)胞系的構(gòu)建

用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)TFEB-GFP 的HeLa細(xì)胞株(TFEB-GFP).對照組病毒收集液侵染的HeLa細(xì)胞作為對照，通過熒光顯微鏡拍照觀察，結(jié)果如圖2(a)所示，穩(wěn)定表達(dá)TFEB-GFP 的HeLa 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中有綠色熒光.

圖2 穩(wěn)定表達(dá)TFEB-GFP HeLa細(xì)胞系的鑒定Fig.2 Identification of the expression of TFEB-GFP in the HeLa stable cell lines

收集細(xì)胞制成蛋白樣品，通過Western blot 證實(shí)實(shí)驗(yàn)組TFEB-GFP 蛋白表達(dá)明顯增高(圖2(b)).結(jié)果表明穩(wěn)定表達(dá)TFEB-GFP 的HeLa 細(xì)胞系構(gòu)建成功.

2.3 Sertraline HCl促進(jìn)TFEB入核

利用穩(wěn)定表達(dá)TFEB-GFP 的HeLa 細(xì)胞模型，對來自 Selleck 的小分子化合物庫中的藥物進(jìn)行篩選.DMSO 為陰性對照，Torin 1(終濃度250 nmol/L)為陽性對照，熒光顯微鏡下拍照觀察TFEB-GFP 的定位，確定Sertraline HCl 能夠促進(jìn)TFEB-GFP 入核，并且以時間(6、12、24 h)依賴性方式誘導(dǎo)TFEB-GFP核聚集(圖3(a)).進(jìn)一步通過核質(zhì)分離方法研究Sertraline HCl 對內(nèi)源性TFEB 細(xì)胞定位的影響.6 孔板中接種適宜密度的HeLa、MDA-MB231 細(xì)胞，24 h后分別換成加了Sertraline HCl(終濃度5μmol/L)的培養(yǎng)基處理24 h，DMSO 為陰性對照，核質(zhì)分離以后，以核內(nèi)TFEB 蛋白量比核內(nèi)參(Histone)蛋白量統(tǒng)計(jì)Sertraline HCl 處理后TFEB 相對核內(nèi)蛋白量，Western blot 檢測結(jié)果如圖3(b，c)所示，Sertraline HCl 處理后，HeLa、MDA-MB231 細(xì)胞核中TFEB 蛋白表達(dá)量明顯比對照組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步確定Sertraline HCl 促進(jìn)TFEB 入核.

圖3 Sertraline HCl促進(jìn)TFEB入核Fig.3 Sertraline HCl promoting TFEB nuclear translocation

2.4 Sertraline HCl促進(jìn)TFEB靶基因表達(dá)

為了研究Sertraline HCl 對HeLa、MDA-MB231細(xì)胞中TFEB 靶基因表達(dá)的影響，以DMSO 作為對照，用10μmol/L Sertraline HCl 處理HeLa、MDAMB231 細(xì)胞48 h 后，收集并裂解細(xì)胞，蛋白免疫印跡技術(shù)檢測結(jié)果如圖4 所示.Sertraline HCl 處理后，HeLa、MDA-MB231 細(xì)胞中 p62、組織蛋白酶B(Cathepsin B)表達(dá)均比對照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.這表明Sertraline HCl 促進(jìn)TFEB 靶基因p62、Cathepsin B 的表達(dá).

圖4 Sertraline HCl促進(jìn)TFEB靶基因的表達(dá)Fig.4 Sertraline HCl promoting the expression of TFEB target genes

2.5 Sertraline HCl促進(jìn)細(xì)胞自噬

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Sertraline HCl 促進(jìn)TFEB 入核并增強(qiáng)TFEB 的轉(zhuǎn)錄活性，而TFEB 調(diào)控很多溶酶體蛋白的表達(dá).因此，進(jìn)一步研究Sertraline HCl 對細(xì)胞自噬的作用.LC3 在自噬形成過程中發(fā)生聚集的原理為：無自噬時，EGFP-LC3 融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時，EGFP-LC3 融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下可以觀察到形成多個明亮的EGFP-LC3 綠色熒光斑點(diǎn)，通過計(jì)數(shù)評價自噬活性的高低.

將穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3 的HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后加入Sertraline HCl(終濃度5μmol/L)，DMSO 為 陰 性 對 照，雷 帕 霉 素(Rapamycin)(終濃度500 nmol/L)為陽性對照.繼續(xù)培養(yǎng)6 h，用4% PFA 室溫固定15～20 min，棄去PFA，PBS 洗3 次，熒光顯微鏡下拍照觀察EGFPLC3 點(diǎn)狀分布.圖5(a)結(jié)果顯示，Sertraline HCl 處理后，EGFP-LC3 綠色亮點(diǎn)聚集，而且數(shù)量比陰性對照增多，說明Sertraline HCl 能夠增加LC3-Ⅱ蛋白的聚集程度，由此表明Sertraline HCl 促進(jìn)HeLa 細(xì)胞自噬體的形成.

圖5 Sertraline HCl促進(jìn)細(xì)胞自噬Fig.5 Sertraline HCl promoting autophagy

在自噬過程中，LC3 在相關(guān)蛋白酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘腖C3-Ⅱ并結(jié)合到自噬體膜上，因此，LC3-Ⅱ蛋白水平直接反映自噬體數(shù)量.LC3-Ⅱ的含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ或LC3-Ⅱ/β-actin 的比例與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)，在某種程度上反映了細(xì)胞的自噬活性[17-18].因此，進(jìn)一步研究了Sertraline HCl 對LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響.將HeLa、MDA-MB231 細(xì)胞培養(yǎng)于6 孔板中，加入10μmol/L Sertraline HCl 常規(guī)培養(yǎng)48 h，DMSO 作為對照，通過蛋白免疫印跡技術(shù)檢測自噬標(biāo)志物L(fēng)C3 的表達(dá)情況.結(jié)果如圖5(b，c)所示，Sertraline HCl 處理的HeLa、MDA-MB231細(xì)胞中 LC3-Ⅱ蛋白水平明顯高于對照組，表明Sertraline HCl 能夠上調(diào)HeLa、MDA-MB231 細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量.

自噬體形成后會運(yùn)送到溶酶體，與其融合形成自噬溶酶體，在自噬發(fā)生時，EGFP-LC3 連同自噬體內(nèi)膜和內(nèi)容物一起被降解；但與LC3 易被降解不同的是，EGFP 在溶酶體中僅表現(xiàn)熒光信號淬滅，本身并不被降解，在自噬溶酶體降解后會釋放出游離的EGFP[19-20].因此，游離EGFP 也可以作為檢測自噬流降解是否發(fā)生的依據(jù).通過蛋白免疫印跡技術(shù)檢測不同終濃度的Sertraline HCl 處理穩(wěn)定表達(dá)EGFPLC3 的HeLa 細(xì)胞12 h 后細(xì)胞中EGFP 蛋白的變化，結(jié)果如圖 5(d)所示，隨著藥物濃度的增加，游離EGFP 蛋白的數(shù)量增加，表明Sertraline HCl 能夠促進(jìn)自噬流.

2.6 Sertraline HCl抑制腫瘤細(xì)胞生長

為了研究Sertraline HCl 是否具有抗腫瘤活性，通過MTT 法檢測Sertraline HCl 對腫瘤細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖6 所示.

圖6 Sertraline HCl對腫瘤細(xì)胞活力的影響Fig.6 Effect of Sertraline HCl on cancer cells viability

Sertraline HCl 在10μmol/L 以上濃度時，HeLa、MDA-MB231 細(xì)胞的活力均受到抑制，并呈濃度梯度依賴性；10μmol/L Sertraline HCl 處理HeLa、MDAMB231 細(xì)胞48 h 時，細(xì)胞活力均出現(xiàn)了明顯降低(P＜0.01)，72 h 更明顯(P＜0.001)，并呈時間梯度依賴性，表明Sertraline HCl 抑制腫瘤細(xì)胞的活力.

3 討 論

TFEB 與人類疾病的發(fā)生存在相關(guān)性，它的激活對許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病和溶酶體疾病的治療有潛在的作用.因此，以精確的時間和組織特異性方式調(diào)節(jié)TFEB 活性的小分子化合物的開發(fā)具有很好的前景.這些小分子有潛力用于眾多的人類疾病的治療，包括肝細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)、巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)、肌肉線粒體功能以及神經(jīng)元細(xì)胞清除等方面.

TFEB 參與細(xì)胞內(nèi)清除的多個途徑，TFEB 可以作為治療靶點(diǎn)用于治療許多與自噬或溶酶體功能障礙有關(guān)的疾病和與有毒聚集物累積相關(guān)的疾病.研究證明調(diào)節(jié)TFEB 的活性具有作為溶酶體疾病治療策略的潛力，因?yàn)樽允?溶酶體途徑的缺陷是這類疾病發(fā)病機(jī)制的重要原因[21-23].

因此，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TFEB-GFP 的HeLa 細(xì)胞系用于篩選和研究激活TFEB 活性小分子化合物具有重要意義.本研究篩選到Sertraline HCl 具有促進(jìn)TFEB 轉(zhuǎn)錄活性的作用.Sertraline HCl 是選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)類的抗抑郁藥[24]，主要用于治療抑郁癥、焦慮癥、強(qiáng)迫癥、恐慌癥和創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙，還可用于早泄[25-26]、神經(jīng)心源性暈厥[2]等疾病的治療.Sertraline HCl 也適合治療包括患阿爾茨海默氏病(AD)在內(nèi)的老年患者的抑郁癥狀[27]，控制AD 患者出現(xiàn)的其他可能由血清素能系統(tǒng)介導(dǎo)的行為問題，如焦慮、易怒和攻擊性等[28].能夠改善伴有抑郁癥的穩(wěn)定型慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者生活質(zhì)量的療效[29]，在治療腦卒中后抑郁癥[30]、糖尿病抑郁癥[31]、冠心病介入術(shù)后抑郁癥[32]、帕金森病后抑郁癥[33]也顯示了良好的臨床效果.Sertraline HCl對腦結(jié)構(gòu)的改善與強(qiáng)迫癥患者的癥狀改善有關(guān)，Tang等[34]研究了Sertraline HCl 對強(qiáng)迫癥患者腦結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示，用Sertraline HCl 進(jìn)行藥物治療12 周后，有11 例強(qiáng)迫癥患者的灰質(zhì)體積顯著增加，小腦活化增加.目前，Sertraline HCl 的抗抑郁療效明顯，但對腫瘤細(xì)胞的作用鮮有報道.

本次實(shí)驗(yàn)利用高效且能穩(wěn)定整合于宿主基因組的慢病毒載體構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)TFEB-GFP 的HeLa細(xì)胞系，為研究TFEB 在HeLa 細(xì)胞中的功能及作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，該細(xì)胞系還為針對TFEB 的靶向性研究提供了一種切實(shí)可行的細(xì)胞模型；同時利用該細(xì)胞模型篩選出了促TFEB 入核藥物Sertraline HCl，該藥物能夠促進(jìn)TFEB 靶基因的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞自噬，具有抗腫瘤活性.自噬在腫瘤細(xì)胞中起著抵抗腫瘤組織微環(huán)境壓力的作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長.當(dāng)細(xì)胞自噬處于一定的水平內(nèi)，主要體現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活的作用，但是也存在過度激活的自噬導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的現(xiàn)象，這也是一個可能的抑瘤機(jī)制[35].因此，可以推測Sertraline HCl 可能通過過度激活細(xì)胞自噬引起腫瘤細(xì)胞的死亡.