李慧杰，李 明，金 鵬，郭文麗，王 雪，王正祥，劉曉光

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院，天津 300457)

甾體化合物具有廣泛的藥理和生理活性，在抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)性功能和生育控制等方面具有極其重要的作用[1-2].天然的甾體化合物往往藥理活性較低，在甾體藥物的特定位點(diǎn)引入羥基可以顯著提高其藥理與生理活性[3-4].甾體化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜且含有多個(gè)非對稱中心，用化學(xué)合成法在甾體化合物的關(guān)鍵位點(diǎn)引入氧原子非常困難，涉及多步復(fù)雜的保護(hù)和去保護(hù)反應(yīng)，如在黃體酮的C11α-羥基引入羥基需要9 步化學(xué)反應(yīng)，而利用黑根霉(Rhizopus nigricans)轉(zhuǎn)化可以一步完成C11α-羥化反應(yīng)生成C11α-羥基黃體酮，得率達(dá)到85%[5].由于微生物轉(zhuǎn)化具有特異性強(qiáng)、效率高、污染低等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于甾體藥物羥基化修飾[6-8].

目前已報(bào)道的具有甾體轉(zhuǎn)化活性的微生物多達(dá)1 500 種，但成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的菌株并不多[4,6].進(jìn)一步研究開發(fā)工業(yè)生產(chǎn)菌種對于改進(jìn)甾體生物轉(zhuǎn)化效率和拓寬微生物催化在甾體工業(yè)中的應(yīng)用范圍具有重要意義.絲狀真菌新月彎孢霉(Curvularia lunata)在工業(yè)上用于C11β 羥化Reichstein S 化合物(RS)，生產(chǎn)具有抗炎活性的氫化可的松[9].C17α-羥基孕酮是合成氫化可的松、潑尼松龍、地塞米松等多種甾體藥物的一個(gè)關(guān)鍵中間體[10]，而C14α-羥基4AD 是合成抗腫瘤化合物C14α-羥基-3，6，17 三酮的關(guān)鍵前體[11].作者在研究新月彎孢霉的甾體底物轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)現(xiàn)新月彎孢霉菌株CICC40301 不能轉(zhuǎn)化RS，但對孕酮、睪酮、雄甾-4-烯-3，17-二酮(4AD)都有明顯的轉(zhuǎn)化活性，通過HPLC、1H NMR、13C NMR 方法確認(rèn)其相應(yīng)的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為C17α-羥基孕酮、C15-羥基睪酮和C14α-羥基4AD.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

新月彎孢霉(Curvularia lunata)CICC40301 為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株.

1.1.2 試劑

甲醇、石油醚、二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙腈，二甲基亞砜-d6(DMSO-d6)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；薄層層析硅膠板，煙臺德信生物科技有限公司.

1.1.3 甾體化合物

孕酮、睪酮和雄甾-4-烯-3，17-二酮(4AD)均由北京紫竹藥業(yè)有限公司提供.

1.1.4 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，瓊脂粉20，115 ℃滅菌 20 min.

YPD 培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 20，酵母粉 10，葡萄糖20，115 ℃滅菌20 min.

1.2 方法

1.2.1 新月彎孢霉的培養(yǎng)及孢子懸浮液的制備

將新月彎孢霉CICC40301 孢子接種于PDA 斜面培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～4 d.待孢子成熟后，將長有新月彎孢霉孢子的PDA 斜面用無菌水洗下分生孢子，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，再用無菌水調(diào)節(jié)孢子懸液至濃度為107mL-1，備用.

1.2.2 新月彎孢霉CICC40301 菌絲的培養(yǎng)

吸取1 mL 濃度為107mL-1的孢子懸液接入50 mL 的 YPD 液體培養(yǎng)基中，放入恒溫?fù)u床180 r/min、28 ℃培養(yǎng)至36 h.

1.2.3 底物的轉(zhuǎn)化

將新月彎孢霉培養(yǎng)36 h 后，將甾體底物孕酮、睪酮和4AD 通過球磨機(jī)研磨，使其顆粒直徑為10～15μm.投入甾體底物使其終質(zhì)量濃度為2 g/L，并添加 1%的 N，N-二甲基酰胺(DMF)作為助溶劑，28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h 后取樣.

1.2.4 高效液相色譜檢測分析

取甾體底物孕酮、睪酮和4AD 及其對應(yīng)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物樣品加入到1.5 mL EP 管中，加入600μL 80%乙腈完全溶解后，經(jīng)0.22μm 膜過濾至液相小瓶中，備用.

色譜條件：色譜柱為C18 柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，乙腈-水(體積比為80∶20)為流動(dòng)相，流量0.8 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10μL，采用紫外檢測器，檢測波長240 nm.本方法中所用乙腈為色譜純，水為去離子水經(jīng)過濾超聲處理.

1.2.5 核磁共振檢測分析

樣品處理：取100 mL 底物發(fā)酵液中的30 mL 于50 mL 離心管，用6 mL 乙酸乙酯萃取，劇烈震蕩，使其與發(fā)酵液充分混合，12 000 r/min 離心5 min，分別萃取3 次，合并有機(jī)相.

產(chǎn)物制備：取有機(jī)相在層析板上點(diǎn)樣.在展開前用展開劑飽和層析缸30 min.將點(diǎn)有樣品的硅膠板放入裝有展開劑的層析缸中加蓋、密封，待展開劑前沿快到頂端時(shí)，取出點(diǎn)樣板后烘干.采用紫外檢測儀觀察層析斑點(diǎn)的顏色和大小.孕酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的展開劑為V(氯仿)∶V(丙酮)∶V(乙酸乙酯)＝5.5∶3.5∶1；4AD、睪酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的展開劑為V(二氯甲烷)∶V(石油醚)∶V(甲醇)∶V(水)＝385∶60∶30∶2.

通過刮板得到產(chǎn)物，加二氯甲烷和甲醇混合液(二氯甲烷與甲醇體積比為5∶1)10 mL 溶解，混勻.將得到的溶液加入到50 mL 的圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷和甲醇得到產(chǎn)物，之后向產(chǎn)物中加入DMSO 將其溶解，將溶解的溶液加入到核磁管中進(jìn)行檢測分析.

核磁共振條件：1H NMR、13C NMR 譜分別用400 MHz 和101 MHz 記錄，布魯克Ascend 400 系列核磁共振儀使用DMSO-d6作為溶劑.

2 結(jié)果與分析

2.1 新月彎孢霉孕酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析

2.1.1 孕酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物HPLC 分析

通過刮板分離得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，HPLC 分析(圖1)顯示，孕酮底物出峰時(shí)間為6.760 min，孕酮兩種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的出峰時(shí)間分別為3.032 min 和3.686 min，其中一種孕酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物純化之后的出峰時(shí)間為3.029 min，并且其轉(zhuǎn)化率為22.2%.

2.1.2 孕酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物表征

1H NMR(400，MHz，DMSO-d6)δ5.623(s，1H，C-4H)，4.011(s，1H，OH)，0.657(s，3H，H-18)，1.139(s，3H，H-19).13C NMR(101，MHz，DMSO-d6)δ 210.37(C-20)，198.54(C-3)，171.63(C-5)，123.40(C-4)，83.60(C-17)，59.57(C-14)，48.15(C-9)，46.26(C-13)，38.64(C-10)，38.30(C-12)，35.80(C-8)，34.12(C-1)，32.35(C-2)，32.30(C-6)，31.62(C-7)，30.83(C-21)，27.44(C-15)，21.52(C-16)，20.31(C-11)，17.17(C-19)，17.17(C-18).

圖1 新月彎孢霉CICC40301孕酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC分析Fig.1 HPLC analysis of the progesterone transformation product catalyzed by Curvularia lunata CICC40301

2.1.3 孕酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物確認(rèn)

根據(jù)孕酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的1H NMR、13C NMR 結(jié)果，碳譜中C17 的化學(xué)位移從孕酮的63.23 變?yōu)?3.60，后者與文獻(xiàn)報(bào)道C17-羥基孕酮的碳譜數(shù)據(jù)一致[12]，氫譜的特征峰(H4＝5.623，H18＝0.657，H19＝1.139)的化學(xué)位移值與文獻(xiàn)報(bào)道C17-羥基孕酮的氫譜數(shù)據(jù)基本一致[13]，鑒于孕酮母核的C17α-H 被OH 取代，故產(chǎn)物確認(rèn)為C17α-羥基孕酮.

2.2 新月彎孢霉雄甾-4-烯-3，17-二酮(4AD)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析

2.2.1 雄甾-4-烯-3，17-二酮(4AD)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物HPLC分析通過刮板分離得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，HPLC 分析(圖2)顯示，4 AD 底物出峰時(shí)間為4.434 min，4 AD 兩種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的出峰時(shí)間分別為2.781 min 和3.059 min，其中一種 4 AD 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物純化后的出峰時(shí)間為3.059 min，并且其轉(zhuǎn)化率為45.1%.

圖2 新月彎孢霉CICC40301 4AD轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC分析Fig.2 HPLC analysis of the 4AD transformation product catalyzed by Curvularia lunata CICC40301

2.2.2 雄甾-4-烯-3，17-二酮(4AD)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物表征

1H NMR(400，MHz，DMSO-d6)δ5.641(s，1H，C-4H)，4.304(s，1H，OH)，0.921(s，3H，H-18)，1.150(s，3H，H-19).13C NMR(101 MHz，DMSOd6)δ218.03(C-17)，197.98(C-3)，170.82(C-5)，123.02(C-4)，78.93(C-14)，52.09(C-13)，46.41(C-9)，38.20(C-10)，37.35(C-12)，35.27(C-1)，33.62(C-2)，32.78(C-6)，31.63(C-7)，28.89(C-8)，25.43(C-15)，24.51(C-16)，18.82(C-11)，17.12(C-19)，16.82(C-18).

2.2.3 4AD 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物確認(rèn)

根據(jù)4AD 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的 1 H NMR、13C NMR 結(jié)果，碳譜中C14 的化學(xué)位移從4AD 的51.67 變?yōu)?8.93，后者與文獻(xiàn)報(bào)道C14-羥基4AD 的碳譜數(shù)據(jù)一致[12]，氫譜的特征峰(H4＝5.641，H18＝0.921，H19＝1.150)的化學(xué)位移值與文獻(xiàn)報(bào)道 C14-羥基4AD 的氫譜數(shù)據(jù)基本一致[13]，鑒于4AD 母核的C14α-H 被OH 取代，故產(chǎn)物確認(rèn)為C14α-4AD.

2.3 新月彎孢霉睪酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析

2.3.1 睪酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物HPLC 分析

通過刮板分離得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，HPLC 分析(圖3)顯示，睪酮底物出峰時(shí)間為4.007 min，睪酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的出峰時(shí)間為2.772 min，純化的睪酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物出峰時(shí)間為2.890 min，并且其轉(zhuǎn)化率為88.2%.

2.3.2 睪酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物表征

1H NMR(400，MHz，DMSO-d6)δ5.609(s，1H，CH4)，4.240(d，1H，J＝5.2 Hz，OH)，4.227(m，1H，H-15)，0.759(s，3H，H-18)，1.143(s，3H，H-19).13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ198.56(C-3)，171.91(C-5)，123.32(C-4)，81.74(C-17)，77.32(C-15)，46.99(C-9)，46.79(C-14)，39.07(C-13)，38.75(C-10)，35.83(C-1)，34.15(C-2)，32.37(C-6)，32.03(C-7)，29.84(C-8)，28.86(C-12)，26.53(C-16)，19.98(C-11)，17.21(C-19)，15.33(C-18).

圖3 新月彎孢霉CICC40301睪酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC 分析Fig.3 HPLC analysis of the testosterone transformation product catalyzed by Curvularia lunata CICC40301

2.3.3 睪酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物確認(rèn)

根據(jù)睪酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的1H NMR、13C NMR 結(jié)果，碳譜中C15 的化學(xué)位移從睪酮的27.43 變?yōu)?7.32，與文獻(xiàn)報(bào)道C15-羥基睪酮的碳譜數(shù)據(jù)一致[12]，氫譜的特征峰(H4＝5.609，H18＝0.759，H19＝1.143)的化學(xué)位移值與文獻(xiàn)報(bào)道的C15-羥基睪酮?dú)渥V數(shù)據(jù)基本一致[13]，故產(chǎn)物確認(rèn)為C15-羥基睪酮.

3 結(jié) 論

新月彎孢霉(Curvularia lunata)CICC40301 能夠轉(zhuǎn)化甾體底物孕酮、雄甾-4-烯-3，17-二酮和睪酮，利用高效液相色譜(HPLC)和核磁共振方法分析鑒定了相應(yīng)的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，結(jié)果為：C17α-羥基孕酮、C14α-羥基4AD、C15-羥基睪酮.轉(zhuǎn)化產(chǎn)物C17α-羥基孕酮是用于合成氫化可的松等多種甾體藥物的重要中間體，C14α-羥基4AD 是合成抗腫瘤化合物C14α-羥基-3，6，17 三酮的關(guān)鍵前體.