王亞平，邢 爽，孫中貫，肖冬光

(教育部工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

高級(jí)醇是指具有3 個(gè)碳鏈以上的一價(jià)醇類，包括正丙醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇、β-苯乙醇等[1].酒中含適量的高級(jí)醇，具有使酒口感協(xié)調(diào)、酒體豐滿的作用；過量則帶有苦澀怪味，給酒帶來不良影響[2].并且，高級(jí)醇在人體內(nèi)的代謝速度較慢，作用時(shí)間較長，當(dāng)高級(jí)醇含量過高時(shí)就會(huì)造成飲后“上頭”[3].白酒中的高級(jí)醇主要通過兩個(gè)途徑生成：一是酵母以氨基酸為基質(zhì)的降解代謝路徑，氨基酸經(jīng)脫氨、脫羧生成比氨基酸少一個(gè)碳原子的高級(jí)醇[4]，在培養(yǎng)基中氨基酸過量時(shí)較易生成；二是酵母以糖為基質(zhì)的合成代謝路徑時(shí)，生成α-酮酸，經(jīng)脫羧、還原生成高級(jí)醇[5]，在培養(yǎng)基中可利用氮源缺乏時(shí)較易生成.

在傳統(tǒng)液態(tài)法白酒發(fā)酵過程中，由于采用純種酒母和糖化酶為糖化發(fā)酵劑，釀酒原料、釀造工藝及微生物種類單一，微環(huán)境體系相對均一化，導(dǎo)致液態(tài)法白酒發(fā)酵體系中可利用氮源含量較低[6]，因而傳統(tǒng)液態(tài)法白酒大多通過糖代謝途徑生成高級(jí)醇，其高級(jí)醇生成量比固態(tài)法白酒高兩倍左右[7]，且液態(tài)法白酒的風(fēng)味物質(zhì)豐富性不如固態(tài)法白酒，酒體相對單薄，缺乏固態(tài)法發(fā)酵白酒的自然感.固態(tài)法白酒存在的主要問題是需要手工操作、勞動(dòng)強(qiáng)度大、生產(chǎn)效率低；而液態(tài)法白酒的高生產(chǎn)效率使之成為了科技工作者研究的目標(biāo).

針對液態(tài)法白酒的酒質(zhì)問題，陳峻[8]提出了通過精選原料、蒸煮排雜、選擇優(yōu)良菌種發(fā)酵等技術(shù)措施.張昊等[9]在研究控制液態(tài)法白酒質(zhì)量的技術(shù)中，認(rèn)為除對原料品質(zhì)的要求及控制蒸煮過程外，延長發(fā)酵時(shí)間可以增加發(fā)酵醪中的酸酯成分.關(guān)于液態(tài)法白酒中風(fēng)味物質(zhì)成分單一這一問題，行業(yè)內(nèi)做了很多研究，通過固液勾兌等方法基本上解決了液態(tài)法白酒口味寡淡問題，但如何降低液態(tài)法白酒中高級(jí)醇的含量，仍然是行業(yè)內(nèi)存在的主要問題.

為了實(shí)現(xiàn)白酒生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高效的目的，本文在傳統(tǒng)液態(tài)法白酒的基礎(chǔ)上，采用純種釀酒酵母與酶制劑協(xié)同傳統(tǒng)大曲糖化發(fā)酵的液態(tài)法大曲酒生產(chǎn)工藝，既保留固態(tài)法大曲酒多菌落發(fā)酵的特征，又彌補(bǔ)了大曲中釀酒酵母和某些釀酒酶系活性的不足[10].從釀酒原料、酵母菌種、接種量、酶制劑用量等角度，研究影響液態(tài)法大曲酒高級(jí)醇含量的主要因素，以及傳統(tǒng)大曲與酵母、酶制劑協(xié)同發(fā)酵作用對高級(jí)醇的影響，優(yōu)化液態(tài)法大曲白酒發(fā)酵工藝，為液態(tài)法大曲酒生產(chǎn)中高級(jí)醇含量的控制提供理論指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 材料

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)A-1、A-2、A-3、A-4、A-5，均為工業(yè)生產(chǎn)用優(yōu)良菌株，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存.

糯高粱、粳高粱、玉米，市售；清香大曲(含粗淀粉50.05%、糖化力792 mg/(g·h)、液化力0.93 g/(g·h)、水分14.23%)，北京紅星股份有限公司；耐高溫α-淀粉酶(2×104U/mL)、糖化酶(1×105U/mL)、酸性蛋白酶(5×104U/g)，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司.

UV-5200 型紫外-可見分光光度計(jì)、手持式糖度計(jì)、Agilent 7890B 型氣相色譜儀、Agilent HPINNOWAX 型色譜柱(30 m×320μm×0.25μm)，美國安捷倫科技有限公司.

1.2 測定方法

采用直接干燥法按照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)·食品中水分的測定》進(jìn)行水分的測定.采用杜馬斯燃燒法按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)·食品中蛋白質(zhì)的測定》進(jìn)行粗蛋白的測定.采用索氏抽提法按照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)·食品中脂肪的測定》進(jìn)行粗脂肪的測定.采用酸水解法按照GB 5009.9—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)·食品中淀粉的測定》進(jìn)行總淀粉的測定.采用分光光度法按照GB/T 15683—2008《大米·直鏈淀粉含量的測定》進(jìn)行直鏈淀粉的測定.采用分光光度法按照GB/T 15686—2008《高粱·單寧含量的測定》進(jìn)行單寧的測定.酒度的測定參見文獻(xiàn)[11]，采用酒精計(jì)法進(jìn)行測定.采用血球計(jì)數(shù)板法測定酵母細(xì)胞數(shù).揮發(fā)酸和總酯采用酸堿滴定指示劑法[12]進(jìn)行測定.還原糖和殘淀粉采用斐林試劑法[13]進(jìn)行測定.高級(jí)醇采用氣相色譜法[14]進(jìn)行測定.淀粉出酒率按照參考文獻(xiàn)[15]計(jì)算.

1.3 種子培養(yǎng)

一級(jí)種子：從試管斜面接種一環(huán)酵母菌于裝有5 mL 玉米糖化醪培養(yǎng)基的20 mL 試管中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h.

二級(jí)種子：將一級(jí)種子轉(zhuǎn)接入裝有100 mL 玉米糖化醪培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，30 ℃靜置培養(yǎng)16 h.

1.4 發(fā)酵工藝實(shí)驗(yàn)

原料粉碎，料液比為1∶3，加液化酶3 U/g 原料，在80～90 ℃下不斷攪拌，液化1 h；待醪液冷卻至60 ℃，加糖化酶60 U/g 原料并不斷攪拌，糖化30 min；醪液冷卻至40 ℃時(shí)，加酸性蛋白酶4 U/g 原料，并不斷攪拌，作用15 min；醪液冷卻至30 ℃時(shí)，根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)的設(shè)置，接入二級(jí)種子酵母菌液和大曲；加水至發(fā)酵液總重為200 g，總體積約為170 mL，用250 mL 三角瓶進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，于30 ℃培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵5 d，取樣分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次[16].

1.4.1 不同原料對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響

分別制備粳高粱、糯高粱和玉米發(fā)酵培養(yǎng)基.加原料用量10%的清香大曲，接種釀酒酵母A-2 種子培養(yǎng)液6×106mL-1，30 ℃靜置發(fā)酵5 d.

1.4.2 酵母菌種對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響

以粳高粱為原料，比較酵母菌種A-1、A-2、A-3、A-4、A-5 的發(fā)酵效果.

選定釀酒酵母A-2 為菌種，分別進(jìn)行不同接種量(2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106mL-1)的實(shí)驗(yàn).

1.4.3 酶制劑對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響

在1.4.2 選定的菌種和接種量的基礎(chǔ)上，進(jìn)行不同糖化酶用量(0、45、60、70、90、105 U/g)和不同酸性蛋白酶用量(0、2、4、6、8、10 U/g)的實(shí)驗(yàn).

1.4.4 大曲用量對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響

在以上實(shí)驗(yàn)選定的液化酶添加量3 U/g、糖化酶添加量60 U/g、酸性蛋白酶添加量4 U/g 的基礎(chǔ)上，進(jìn)行不同大曲用量(0、5%、10%、20%、30%、40%)的實(shí)驗(yàn).

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)平行樣.采用Excel 2016統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并使用t 檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)組與對照組之間差異進(jìn)行顯著性分析，*表示有顯著差異(P＜0.05)，**表示有極顯著差異(P＜0.01).

2 結(jié)果與分析

2.1 不同原料對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響

不同原料的理化性質(zhì)及對白酒液態(tài)發(fā)酵的影響見表1 和表2.糯高粱組為對照組，結(jié)果表明：就發(fā)酵酒度來看，糯高粱原料最低，粳高粱與玉米原料相差不大；從揮發(fā)酸含量來看，糯高粱原料最高，粳高粱原料次之，玉米原料最低；3 種原料發(fā)酵的總酯含量無明顯差別；就高級(jí)醇含量來看，粳高粱原料、糯高粱與玉米原料相差不大；由于不同釀酒原料的品質(zhì)差異，如單寧含量、支鏈淀粉與直鏈淀粉含量不同等因素造成白酒液態(tài)法發(fā)酵品質(zhì)的差異.綜合比較認(rèn)為，粳高粱原料更適合液態(tài)法大曲酒生產(chǎn).

表1 不同原料的理化性質(zhì)Tab.1 Physical and chemical properties of different raw materials

表2 不同原料對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響Tab.2 Effect of different materials on liquid fermentation of Daqu Baijiu

2.2 酵母菌種對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響

2.2.1 菌種

酵母菌種對液態(tài)發(fā)酵大曲酒理化指標(biāo)的影響見表3，對主要高級(jí)醇含量的影響見圖1.結(jié)果表明：5株酵母菌種發(fā)酵酒度無明顯差別；揮發(fā)酸含量菌種A-1 最高，A-4 最低，其余3 株產(chǎn)酸相差不大；從總酯含量看，A-2、A-5 產(chǎn)酯能力較強(qiáng)，其余3 株相對較弱；從高級(jí)醇產(chǎn)量看，A-3 最高，A-2 最低.從圖1 可以看出，與A-1 相比，A-2、A-3、A-4 的異戊醇含量有極顯著差異.綜上所述，在相同工藝條件下，來源不同的釀酒酵母由于其遺傳多樣性在酒度、揮發(fā)酸、總酯和總高級(jí)醇含量上有所不同.綜合比較，釀酒酵母A-2 產(chǎn)高級(jí)醇總量最低、產(chǎn)酯能力較強(qiáng)、產(chǎn)揮發(fā)酸相對較少，比較適合用于液態(tài)法大曲酒生產(chǎn)用菌株，因此下面的實(shí)驗(yàn)以釀酒酵母A2 為菌種.

表3 酵母菌種對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響Tab.3 Effect of yeast strain on liquid fermentation of Daqu Baijiu

圖1 酵母菌種對液態(tài)發(fā)酵大曲酒中高級(jí)醇的影響Fig.1 Effect of yeast strain on higher alcohol in liquid fermentation of Daqu Baijiu

2.2.2 酵母接種量

酵母接種量對液態(tài)發(fā)酵大曲酒酒度的影響見表4，對主要高級(jí)醇含量的影響見圖2.

表4 酵母接種量對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響Tab.4 Effect of yeast inoculation concentration on liquid fermentation of Daqu Baijiu

圖2 酵母接種量對液態(tài)發(fā)酵大曲酒中高級(jí)醇的影響Fig.2 Effect of yeast inoculation concentration on higher alcohol in liquid fermentation of Daqu Baijiu

從發(fā)酵結(jié)果看，隨著酵母接種量從2×106mL-1增加至6×106mL-1，酒度明顯增加；繼續(xù)增大接種量，酒度增加不明顯.酵母接種量為2×106mL-1時(shí)總高級(jí)醇含量最低，接種量在4×106mL-1以上時(shí)總高級(jí)醇含量幾乎不再增加.從各高級(jí)醇的結(jié)果來看，異戊醇先升高后降低，其余3 種高級(jí)醇隨著接種量的增加，含量逐漸增加.綜合考慮酒度和高級(jí)醇含量酵母接種量以6×106mL-1為宜.

2.3 酶制劑用量對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響

2.3.1 糖化酶用量

糖化酶用量對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響見表5，對主要高級(jí)醇含量的影響如圖3 所示.

表5 糖化酶用量對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響Tab.5 Effect of the amount of glucoamylase on liquid fermentation of Daqu Baijiu

圖3 糖化酶用量對液態(tài)發(fā)酵大曲酒中高級(jí)醇的影響Fig.3 Effect of glucoamylase on higher alcohol in liquid fermentation of Daqu Baijiu

從酒度來看，當(dāng)糖化酶的用量由0 U/g 增加到45 U/g 時(shí)，酒度從(10.37±0.10)%提高到(10.60±0.05)%；從高級(jí)醇含量的變化來看，隨著糖化酶用量增加，正丙醇、異丁醇先降低后穩(wěn)定，異戊醇逐漸增多，苯乙醇含量變化較小.總高級(jí)醇含量呈先下降后升高的趨勢，當(dāng)糖化酶添加量為60 U/g 時(shí)，高級(jí)醇總量最低，為(429.58±5.12)mg/L.這主要原因是適量的糖化酶用量，使淀粉的水解與糖的發(fā)酵達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，而適量的糖濃度有利于酵母的酒精發(fā)酵，在此條件下高級(jí)醇的生成量減少.由此可見，通過調(diào)節(jié)糖化酶的用量，協(xié)調(diào)淀粉糖化與酵母酒精發(fā)酵的平衡，可適當(dāng)降低液態(tài)法大曲酒中高級(jí)醇的含量.

2.3.2 酸性蛋白酶用量

酸性蛋白酶用量對發(fā)酵培養(yǎng)基中α-氨基氮含量的影響見表6，對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響見表7，對主要高級(jí)醇含量的影響如圖4 所示.

表6 酸性蛋白酶對發(fā)酵培養(yǎng)基中α-氨基氮含量的影響Tab.6 Effect of the amount of acid protease on the content of alpha amino nitrogen in fermentation medium

表7 酸性蛋白酶用量對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響Tab.7 Effect of the amount of acid protease on liquid fermentation of Daqu Baijiu

圖4 酸性蛋白酶用量對液態(tài)發(fā)酵大曲酒中高級(jí)醇的影響Fig.4 Effect of the amount of acid protease on higher alcohol in liquor fermentation of Daqu Baijiu

對照表5、表6 和圖4，隨著酸性蛋白酶用量的增加，培養(yǎng)基中α-氨基氮含量逐漸升高；從酒度看，酸性蛋白酶用量的影響不明顯；從高級(jí)醇含量看，隨著酸性蛋白酶用量的增加，高級(jí)醇總量和各主要高級(jí)醇含量都呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，當(dāng)酸性蛋白酶用量為4 U/g、培養(yǎng)基中氨基氮含量為(90.08±0.83)mg/L 時(shí)，總高級(jí)醇含量最低為(431.29±2.93)mg/L.這是因?yàn)楫?dāng)培養(yǎng)基中氨基酸充足時(shí)，酵母通過氨基酸降解代謝途徑生成較多的高級(jí)醇；而在培養(yǎng)基中氨基酸缺少的情況下，酵母通過合成代謝途徑，以糖為基質(zhì)生成較多的高級(jí)醇；當(dāng)培養(yǎng)基中氨基酸含量和酵母菌的需求量相適應(yīng)時(shí)，高級(jí)醇的生成量最低.由此可見，通過調(diào)節(jié)白酒發(fā)酵體系中酸性蛋白酶的用量可適當(dāng)調(diào)節(jié)成品白酒中高級(jí)醇的含量.

2.4 大曲用量對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響

大曲用量對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響見表8，對主要高級(jí)醇含量的影響如圖5 所示.

表8 大曲用量對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響Tab.8 Effect of the amount of Daqu on liquid fermentation of Daqu Baijiu

圖5 大曲用量對液態(tài)發(fā)酵大曲酒中高級(jí)醇的影響Fig.5 Effect of the amount of Daqu on higher alcohol in liquid fermentation of Daqu Baijiu

從酒度和淀粉出酒率看，隨著大曲用量的增加，先升高后逐漸降低.大曲的使用豐富了醪液中的酶系，如纖維素酶可將原料中的纖維素分解為可發(fā)酵性糖，適量的蛋白酶可增加發(fā)酵液中氨基酸的含量，有利于酵母菌的生長與酒精發(fā)酵；但隨著大曲用量的繼續(xù)增加，大曲中各種微生物群落的生長和代謝會(huì)消耗發(fā)酵液中的可發(fā)酵性糖，導(dǎo)致酒度和出酒率下降；當(dāng)大曲用量達(dá)40%時(shí)，酒度下降達(dá)20%左右.從高級(jí)醇含量看，隨著大曲用量的增加，高級(jí)醇含量明顯下降；當(dāng)大曲為 40%時(shí)，高級(jí)醇總量為(207.73±1.03)mg/L，與不加大曲的對照相比(519.07±11.47 mg/L)，高級(jí)醇含量降低了59.98%.大曲的使用增加了發(fā)酵醪液中的微生物種類，這些微生物與酵母對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭性利用，使酵母的生長代謝受到一定抑制，從而大大降低高級(jí)醇的生成量.可見通過調(diào)節(jié)大曲用量，協(xié)調(diào)傳統(tǒng)大曲中的微生物與釀酒酵母的相互作用，可以有效地降低液態(tài)法大曲酒中高級(jí)醇的含量.

3 結(jié) 語

從釀酒原料、酵母菌、釀造用酶(糖化酶、酸性蛋白酶)和大曲用量等多個(gè)因素的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，以粳高粱為原料、釀酒酵母A-2 為菌種，在酵母接種量6×106mL-1、糖化酶用量60 U/g、酸性蛋白酶用量4 U/g、大曲用量 40%的條件下，高級(jí)醇含量為(207.73±1.03)mg/L，相比初始發(fā)酵條件下的高級(jí)醇含量(434.62±4.06 mg/L)下降了52.18%，但同時(shí)淀粉出酒率下降了24.58%.由此說明采用傳統(tǒng)大曲與純種培養(yǎng)的釀酒酵母和商品酶制劑協(xié)同糖化發(fā)酵，可有效降低液態(tài)法白酒高級(jí)醇含量高的問題，這為液態(tài)法白酒品質(zhì)的提高開辟了新的方法.但是，在白酒實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)綜合考慮出酒率、高級(jí)醇含量、產(chǎn)品質(zhì)量以及生產(chǎn)成本等因素，確定合理大曲用量，將高級(jí)醇含量控制在合適的范圍.除大曲用量外，酵母菌種是影響液態(tài)法白酒高級(jí)醇含量的又一重要因素.本研究所用菌種均為生產(chǎn)上使用的工業(yè)菌株，若采用現(xiàn)代分子生物技術(shù)對釀酒酵母的高級(jí)醇代謝進(jìn)行改造，即可實(shí)現(xiàn)在大曲用量較少的情況下生成適量的高級(jí)醇，達(dá)到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的目的，這將是我們下一步研究的重點(diǎn).