張明瑞 周盈 李福秋 姚春麗 楊鑫 龔杰 趙飛

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科，長(zhǎng)春 130022；2.長(zhǎng)春市中心醫(yī)院，長(zhǎng)春 130051；3.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206)

孢子絲菌病(sporotrichosis)是由孢子絲菌復(fù)合體(Sporothrixcomplex)感染皮膚、皮下組織、黏膜和局部淋巴系統(tǒng)所引起的慢性感染性疾病[1]。病程較長(zhǎng)，皮損可固定于局部，或沿淋巴管走行，嚴(yán)重者可通過血行系統(tǒng)播散，引起內(nèi)臟器官的感染，也有報(bào)道稱吸入的孢子可直接引起肺部感染[2]。隨著分子檢測(cè)手段的不斷發(fā)展，通過對(duì)基因序列的種系研究表明，申克孢子絲菌是由多個(gè)親緣種構(gòu)成的復(fù)合體[3]，其中球形孢子絲菌(Sporothrixglobosa)、申克孢子絲菌(Sporothrixschenckiisensustricto)、巴西孢子絲菌(Sporothrixbrasiliensis)以及盧里艾孢子絲菌(Sporothrixluriei) 是臨床感染中最常見的致病菌，其余孢子絲菌多為環(huán)境菌株，例如墨西哥孢子絲菌(Sporothrixmexicana)[4]。研究表明，不同種之間在致病力及藥物敏感性方面存在明顯差異[5-8]。因此，在孢子絲菌病的診斷及治療過程中，對(duì)病原菌鑒定到種是十分必要的。本研究擬建立一種快速、靈敏和特異的巴西孢子絲菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，精準(zhǔn)鑒定巴西孢子絲菌，為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查以及臨床快速診斷提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株與DNA提取

實(shí)驗(yàn)菌株：巴西孢子絲菌、球形孢子絲菌、申克孢子絲菌各1株，常見致病真菌其他種屬28株(見表1)。其中，申克孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)株CBS498.86T，巴西孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)株CBS 120339T，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所醫(yī)學(xué)真菌保藏中心惠贈(zèng)，其余菌種來源于北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心菌種保藏中心；3株表皮常見細(xì)菌的核酸，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所診斷室惠贈(zèng)。

上述所有菌種均經(jīng)過形態(tài)及分子鑒定至種水平。健康志愿者皮膚組織1份，BALB/c小鼠組織1份。上述菌種及組織標(biāo)本使用QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN 51306) 試劑盒按操作手冊(cè)提取核酸，提取的核酸-20℃冰箱保存。

1.2 主要試劑、儀器及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2×Taqman PCR MasterMix (Solarbio)；Nuclease-free water (Promega)；Potato Dextrose Agar 培養(yǎng)基(BD 211550)；QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN 51306)。Real-time PCR儀C1000 Thermal Cycler (BIO RAD); Nanodrop2000C (Thermo)。BALB/c小鼠，雌性，6～10周齡，體重25～30 g。

表1 文中涉及的DNA及菌株列表

1.3 引物與探針

對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中孢子絲菌所有種屬ITS基因序列進(jìn)行比對(duì)，選取巴西孢子絲菌特異性序列，使用Primer Express Version軟件設(shè)計(jì)引物及TaqMan探針，并進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整，熒光標(biāo)記為Cy5，引物及探針序列見表2。引物及探針序列由上海生物工程股份有限公司合成。

表2 引物及探針序列

1.4 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化

體系退火溫度從55℃～62℃進(jìn)行梯度優(yōu)化，確定擴(kuò)增的最優(yōu)退火溫度。優(yōu)化檢測(cè)體系：2×Taqman PCR MasterMix 12.5 μL，上游引物Sb-ITS-F(25 μmol/L) 0.2 μL，下游引物Sb-ITS-R(25 μmol/L) 0.2 μL，探針Sb-ITS-MGB-P(25 μmol/L) 0.1 μL，DNA模板 5.0 μL，Nuclease-free water 補(bǔ)至25.0 μL。體系使用BIO-RAD C1000 Thermal Cycler real-time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性15s，58℃退火30s，45個(gè)循環(huán)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光PCR體系特異性、靈敏度以及檢測(cè)限的測(cè)定

使用35種其他常見病原菌、人及小鼠基因組(見表1)進(jìn)行體系特異度驗(yàn)證。將巴西孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)株(CBS 120339T)核酸進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋(濃度從2ng/μL～0.2fg/μL，共計(jì)8個(gè)梯度濃度)，進(jìn)行靈敏度及檢測(cè)下限的測(cè)定。

1.6 感染動(dòng)物模型建立、組織培養(yǎng)及核酸提取

將巴西孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)株(CBS 120339T)轉(zhuǎn)種至PDA培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，30℃，培養(yǎng)14 d。生理鹽水沖洗培養(yǎng)基表面，收集菌液，無菌紗布過濾，除去菌絲及培養(yǎng)基成份，3500 r/min，離心收集孢子。棄上清，沉淀用少量無菌生理鹽水重懸，孢子懸液在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液孢子濃度至107cells/mL。使用一次性無菌注射器吸取0.2 mL孢子懸液，腹腔注射感染BALB/c小鼠。感染14 d后脫頸處死，取臟器(腦、肝、肺、脾、腎、淋巴結(jié))勻漿，取100 μL進(jìn)行核酸提取及熒光PCR檢測(cè)，再取稀釋100倍后勻漿液100 μL接種在含有氯霉素的PDA培養(yǎng)基。

1.7 結(jié)果判讀

熒光PCR檢測(cè)每次須設(shè)立無模板對(duì)照(NTC)、陰性對(duì)照(NEG)和陽(yáng)性對(duì)照(POS)，只有NTC(-)、NEG(-)、POS(+)，判定為有效擴(kuò)增。檢測(cè)為有效擴(kuò)增時(shí)，Ct值<40為陽(yáng)性結(jié)果；Ct值>40為陰性結(jié)果。接種感染動(dòng)物的6種組織勻漿的培養(yǎng)基置于30℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7 d后觀察，并設(shè)置陽(yáng)性培養(yǎng)和空白對(duì)照。7 d后，有孢子絲菌菌落生長(zhǎng)，為培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果；30 d后，仍無菌落生長(zhǎng)則為培養(yǎng)陰性結(jié)果。

1.8 倫理聲明

本實(shí)驗(yàn)中使用的人類基因組DNA及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均經(jīng)過吉林大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2018-018)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理的要求，符合國(guó)家科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》等法規(guī)的規(guī)定。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR體系優(yōu)化

通過對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)孢子絲菌屬ITS序列對(duì)比，共設(shè)計(jì)出3套引物及探針組合。3套體系對(duì)于非孢子絲菌屬其他核酸均展示出良好特異性，但其中兩套體系對(duì)于申克孢子絲菌重復(fù)驗(yàn)證時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。最終，1套不會(huì)引起屬內(nèi)的非特異性擴(kuò)增的TaqMan MGB體系定為最終檢測(cè)體系(見表2)。在55～62℃范圍內(nèi)的退火溫度下，標(biāo)準(zhǔn)濃度核酸檢測(cè)Ct值相差0.64，經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)，選用Ct值最小的58℃作為最適退火溫度。

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR方法的特異性及檢測(cè)限的評(píng)價(jià)

本方法對(duì)33種常見病原菌、人類基因組以及小鼠基因組檢測(cè)結(jié)果均為陰性，特異性可達(dá)100%。 使用濃度從2 ng/mL～0.2 fg/mL的巴西孢子絲菌核酸擴(kuò)增獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線及對(duì)數(shù)曲線見圖1。按照優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行熒光PCR，每個(gè)濃度梯度做3個(gè)平行樣。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)中實(shí)時(shí)熒光PCR體系檢測(cè)限為100 fg。

2.3 感染動(dòng)物模型組織培養(yǎng)及熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

感染小鼠臟器勻漿培養(yǎng)，除腦組織外，培養(yǎng)結(jié)果全部陽(yáng)性。對(duì)生長(zhǎng)的真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子鑒定，均為巴西孢子絲菌，證明感染模型建立成功，并且孢子由腹腔播散，引起多臟器感染(見圖2)。6種組織勻漿核酸熒光PCR檢測(cè)結(jié)果，除腦組織陰性外，其余5種組織巴西孢子絲菌核酸檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，Ct值30.55～38.78(見圖3)。

3 討 論

巴西孢子絲菌是孢子絲菌復(fù)合體中重要的臨床致病菌，主要分布在巴西。其宿主除了人類之外，也可引起以貓等動(dòng)物的感染。貓的口腔環(huán)境溫度為37.7～39.1℃，pH值為7.5～8.0，十分有利于巴西孢子絲菌酵母細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖。通過感染動(dòng)物的抓咬，巴西孢子絲菌不僅能夠引起人類的感染，也可在動(dòng)物之間傳播，成為其主要的傳播途徑[9]。作為重要的人畜共患病，由巴西孢子絲菌引起的孢子絲菌病，常具有較重的臨床表現(xiàn)，并且能夠引起內(nèi)臟及鄰近骨的感染，甚至侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致宿主死亡[10-12]。近些年，孢子絲菌病報(bào)道不斷增多，尤其是臨床表現(xiàn)嚴(yán)重的病例。在巴西，僅有記載的巴西孢子絲菌感染病例就超過4000例，并且由于孢子絲菌病不是必須上報(bào)的病種，其真實(shí)感染情況要遠(yuǎn)高于記載數(shù)據(jù)[9]。

目前孢子絲菌診斷方法中，組織標(biāo)本培養(yǎng)仍然是金標(biāo)準(zhǔn)[13]。但由于培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，通常需要2～4周，不適用于臨床的快速診斷以及流行病學(xué)調(diào)查，因此基于核酸檢測(cè)的分子診斷逐漸成為研究熱點(diǎn)。目前應(yīng)用于孢子絲菌檢測(cè)及鑒定的分子手段主要包括“生物條形碼”的擴(kuò)增測(cè)序[3,14-18]、巢式PCR[19-20]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP )[21]、滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification, RCA)[22]以及特異性引物PCR[23]等。上述檢測(cè)方法中，除巢式PCR外，其余方法均能夠直接鑒定到孢子絲菌種水平。但是基于普通PCR的測(cè)序或者再酶切等方法，往往耗時(shí)較長(zhǎng)，并且RFLP以及RCA只能用于純菌的檢測(cè)。2015年，由Rodrigues[23]建立的特異性引物PCR，依據(jù)不同孢子絲菌特定區(qū)域特異性PCR產(chǎn)物片段大小，可檢測(cè)并區(qū)分幾種常見的孢子絲菌。其對(duì)巴西孢子絲菌的檢測(cè)下限為100fg，并通過感染小鼠的內(nèi)臟組織模擬臨床標(biāo)本，評(píng)估其檢測(cè)組織中的病原菌的能力，是目前報(bào)道的最靈敏和特異的孢子絲菌PCR檢測(cè)方法。熒光PCR技術(shù)憑借其靈敏度及特異性高，耗時(shí)短，重復(fù)性好、全封閉反應(yīng)等重多優(yōu)勢(shì)，逐漸成為病原菌鑒定及診斷重要的工具，并且已經(jīng)廣泛且有效地運(yùn)用在細(xì)菌(結(jié)核分枝桿菌)、病毒(HIV，HCV)以及一些真菌(曲霉)等病原微生物的診斷[24]。但是在孢子絲菌屬的檢測(cè)中應(yīng)用較少。

圖1實(shí)時(shí)熒光PCR體系對(duì)巴西孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度核酸的擴(kuò)增曲線(左)及模板濃度對(duì)數(shù)曲線(右)圖2巴西孢子絲菌感染小鼠內(nèi)臟組織培養(yǎng)結(jié)果(將內(nèi)臟組織勻漿稀釋100倍后，取100μL涂PDA平板，從左至右依次為腦、肝、肺、脾、腎、淋巴結(jié))

Fig.1The amplification curves of the series gradient concentration templates (left) and standard curve of the real-time PCR assays(right).(1：10ng，2：1ng，3：100pg，4：10pg，5：1pg，6：100fg，7：10fg，8：1fg，9：NTC)Fig.2The culture results of tissues infected byS.brasiliensis.(left to right: brain, liver, lung, spleen, kidney and lymph nodes)

圖3實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)巴西孢子絲菌感染小鼠內(nèi)臟組織勻漿Ct值(Ct值從小到大以此為脾30.55，肝30.82，淋巴結(jié)34.04，腎34.46，肺38.78，腦組織為陰性結(jié)果)

Fig.3The Ct values of tissues infected byS.brasiliensisdetected by real-time PCR.(spleen 30.55, liver 30.82, lymph node 34.04, kidney 34.46, lung 38.78, brain tissue was negative.)

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)通常包括ITS1、5.8S和ITS2，長(zhǎng)度一般在500～750 bp。ITS區(qū)在進(jìn)化過程中承受的自然選擇壓力比較小，能容忍更多的變異。其在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出廣泛的多態(tài)性，在親緣關(guān)系接近的物種中也能夠表現(xiàn)出差異，即具有種內(nèi)相對(duì)一致，種間差異明顯的特征。因而廣泛應(yīng)用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中。ITS序列具有高拷貝數(shù)的特點(diǎn)，在每個(gè)單倍染色體基因組中拷貝數(shù)超過200個(gè)，提高檢測(cè)的靈敏度。孢子絲菌屬中，巴西孢子絲菌的基因序列較保守，種間相似度很高，而申克孢子絲菌種內(nèi)序列具有很多差異位點(diǎn)[25]。這些差異片段，很容易導(dǎo)致屬內(nèi)的非特異性擴(kuò)增，增加了特異性引物及探針的設(shè)計(jì)難度。同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光PCR要求其目的片段長(zhǎng)度為100～150 bp，在較短的基因片段上，既要設(shè)計(jì)出能夠擴(kuò)增巴西孢子絲菌引物，同時(shí)也要設(shè)計(jì)出符合熒光PCR要求的探針，也是本研究的一個(gè)難點(diǎn)。通過軟件比對(duì)以及手動(dòng)調(diào)整序列，我們共獲得3套候選的引物及探針組合。經(jīng)驗(yàn)證后，得到1套含有TaqMan MGB探針的體系(見表2)，這套體系靈敏度及特異性良好，檢測(cè)下限為100 fg。雖然與特異性引物檢測(cè)方法的檢測(cè)下限相同，但是本研究方法無論從操作步驟、檢測(cè)時(shí)間、結(jié)果讀取以及污染風(fēng)險(xiǎn)方面，均具有明顯的優(yōu)勢(shì)。為進(jìn)一步驗(yàn)證本研究方法對(duì)組織中巴西孢子絲菌感染的檢測(cè)情況，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了小鼠感染模型，并與組織培養(yǎng)進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，熒光PCR結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)-培養(yǎng)方法對(duì)不同組織的檢測(cè)結(jié)果一致。目前國(guó)內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)巴西孢子絲菌，因此本實(shí)驗(yàn)方法只能通過標(biāo)準(zhǔn)株構(gòu)建，并通過感染動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證。缺乏臨床菌株的驗(yàn)證，是本研究的不足之處。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功建立巴西孢子絲菌的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法，并進(jìn)行了感染動(dòng)物模型驗(yàn)證。該方法可以為流行病學(xué)研究及監(jiān)測(cè)，甚至臨床診斷提供技術(shù)支持。