熊瑛 陳婷 柴寶 曾飛鵬 孫文文 吳波

(1.深圳市婦幼保健院皮膚科，深圳 518000；2.深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院皮膚科，深圳 518000)

甲真菌病是甲病中最常見的疾病之一，紅色毛癬菌是其主要病原菌[1]。甲真菌病的發(fā)病率高，具有可傳染性、治療周期長和復(fù)發(fā)率高的特點，目前已經(jīng)成為危害公共衛(wèi)生的重大問題。甲真菌病傳統(tǒng)的治療以局部外用和系統(tǒng)口服為主，局部治療只適合淺表感染，系統(tǒng)治療存在一定不良反應(yīng)，而且與其他藥物有相互作用，不適用于合并較多基礎(chǔ)疾病或者活動肝炎患者。

近年來，臨床研究表明，多種激光可能對甲真菌病有較好的療效。Q開關(guān)Nd: YAG 1064/532nm激光在臨床上可顯著改善甲真菌病的癥狀[2-3]，長脈沖Nd：YAG 1064nm激光治療遠端側(cè)位甲下型的甲真菌病效果也較滿意[4]，強脈沖光在體外也能抑制紅色毛癬菌的生長和致病性[5]。目前理論認為激光是通過選擇性光熱解原理，對真菌的光熱作用誘導(dǎo)殺真菌活性[6]，但具體哪種激光效果最佳，或者在什么參數(shù)設(shè)置能最大程度抑制真菌？真菌在激光照射后，通過光熱作用發(fā)生了什么樣的改變，目前也尚未明確。據(jù)此，本研究擬比較市面上常用的激光類型，并在不同的能量下對紅色毛癬菌生長的影響，以及探討可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

角蛋白酶降解底物采用Keratin-Azure(美國 Sigma 公司)；實驗所用臨床分離的紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所惠贈，菌株號為CMCC(F)T1a。分光光度計購于Thermo Scientific公司。

1.2 方法

菌落的制備 制備菌懸液受試菌株于沙堡培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后，將孢子和菌絲洗落于生理鹽水中，經(jīng)過漩渦震蕩器震蕩，用無菌紗布過濾去除大的菌絲團塊及雜質(zhì)，用比濁管調(diào)整菌懸液濃度至2×106CFU/mL備用。將制好的孢子懸液，用移液器取 20 μL分別接種于沙氏瓊脂培養(yǎng)基中央，28℃培養(yǎng) 9 d后備用。

實驗分組及激光照射 4種激光(不同激光設(shè)備參數(shù)見表1)，每種分別設(shè)低能量、中能量、高能量、未照光組(對照組)，對上述培養(yǎng)皿上的菌落進行垂直照射，照光時激光頭距離平皿約 5 cm。激光束照射整個菌落，以螺旋狀移動，從周圍直至中心。每個菌落照射 25 ～ 30 個光斑，每個菌落表面全部照射約 1 min 后，暫停 2 min，如此反復(fù)照射 3次。

測定菌落直徑 激光照射結(jié)束后，繼續(xù)放回30℃恒溫培養(yǎng)箱中。在激光照射前(第0天)、照射后第1天、第3天、第7天用電子游標(biāo)卡尺測量并記錄菌落直徑大小(可精確至0.00 mm)，比較激光照射前后不同能量組菌落直徑的變化差異，每個能量組設(shè)有3個重復(fù)。

處理誘導(dǎo)底物 收集健康成年人的正常甲，將其剪碎后,用無菌生理鹽水清洗2 次,75%乙醇清洗1 次，再用無菌蒸餾水清洗2 次。清洗后的甲磨成粉末狀，再用紫外線照射滅菌30 min 備用。

制備角蛋白酶粗提液 在盛有20 mL 液體培養(yǎng)基(MgSO40.5 g/L，K2HPO41.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，200 mg/L 氯霉素，pH 7.5，120 ℃高壓滅菌15 min)的5 個三角燒瓶(容積50 mL)中，利用微量移液管分別移入1mL的2×106CFU/mL菌懸液，再分別加入甲粉末0.1 g，另外1個不加任何底物作為空白對照組。所有三角燒瓶于27 ℃下震蕩培養(yǎng)(130×g)18～21 d后，分別將混懸液倒入50 mL 的離心管中，4390×g 離心10 min，提取10 mL 上清液。

測定角蛋白酶活性 取激光照射的第7d菌懸液測角蛋白酶活性。在5個離心管(容積10 mL)中分別加入2 mL 緩沖液(10 mg keratin-azure、200 mmol/L Tris-HCL、100 mmol/L CaCl2，調(diào)整pH 至8.0)，再分別加入各角蛋白酶粗提液3 mL，37℃水浴培養(yǎng)72 h，然后9000×g 離心5 min，取上清液。將上述上清液用分光光度計測定595 nm 處的A值，以不含角蛋白酶粗提液，含等量Keratin-Azure的CaCl2緩沖液作為陰性對照組。595 nm 處A 值較陰性對照組每改變0.01相當(dāng)于1 U角蛋白酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包處理，數(shù)據(jù)用幾何均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(G±s)表示，應(yīng)用方差分析和t檢驗對數(shù)據(jù)進行分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同激光不同能量對紅色毛癬菌角蛋白酶活性的影響

實驗所用最低能量組的不同激光對紅色毛癬菌產(chǎn)生角蛋白酶的活性均無明顯抑制作用(與未照射組比較，P>0.05)。2～4J/cm2(中～高能量)Q開關(guān)Nd: YAG 532nm激光、4～8J/cm2(中～高能量)Q開關(guān)Nd: YAG 1064nm激光、4J/cm2(高能量)的長脈寬Nd: YAG 1064nm激光能明顯抑制紅色毛癬菌的角蛋白酶活性(與未照射組比較，P<0.05)。而不同能量(10～40 J/cm2)脈沖強光組與未照射組的紅色毛癬菌的角蛋白酶活性比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05(見表2)。高能量密度照射時，不同激光對紅色毛癬菌產(chǎn)生角蛋白酶活性的抑制作用由高到低分別為Q開關(guān)Nd: YAG 1064nm激光、Q開關(guān)Nd: YAG 532nm激光、長脈寬Nd: YAG 1064nm激光和脈沖強光。

2.2 不同激光不同能量對紅色毛癬菌菌落直徑的影響

Q開關(guān)Nd: YAG 532nm激光在不同能量時對紅色毛癬菌菌落直徑的影響 紅色毛癬菌在接受不同能量激光照射后第1天、第3天、第7天的菌落直徑比較顯示，當(dāng)Q開關(guān)Nd: YAG 532nm激光能量達到2～4J/cm2(中～高能量)時，紅色毛癬菌的菌落直徑明顯小于陰性對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異，表明此能量激光對菌落的生長產(chǎn)生了抑制作用。而Q開關(guān)Nd: YAG 532nm激光能量為1J/cm2(低能量)時，對紅色毛癬菌菌落的生長無明顯抑制作用。見圖1。

Q開關(guān)Nd: YAG 1064nm激光在不同能量時對紅色毛癬菌菌落直徑的影響 紅色毛癬菌在接受不同能量Q開關(guān)Nd: YAG 1064nm激光照射后第1天、第3天、第7天的菌落直徑比較顯示，當(dāng)Q開關(guān)Nd: YAG 1064nm激光能量達到4 ～8J/cm2(中～高能量)時，紅色毛癬菌的菌落直徑明顯小于陰性對照組，表明此能量對菌落的生長產(chǎn)生了抑制作用。而Q開關(guān)Nd: YAG 1064nm激光能量為2J/cm2(低能量)，對紅色毛癬菌菌落的生長無明顯抑制作用。見圖2。

長脈寬Nd: YAG 1064nm激光在不同能量時對紅色毛癬菌菌落直徑的影響 不同能量的長脈寬Nd: YAG 1064nm激光照射紅色毛癬菌之后第1天、第3天、第7天的菌落直徑比較顯示，長脈寬Nd: YAG 1064nm激光激光能量達到4J/cm2(高能量)，紅色毛癬菌的菌落直徑小于陰性對照組，表明此能量對菌落的生長產(chǎn)生了抑制作用。而能量為2J/cm2(中能量)時，對紅色毛癬菌菌落的生長無明顯抑制作用。見圖3。

585nm脈沖強光在不同能量時對紅色毛癬菌菌落直徑的影響 不同能量的波長585nm脈沖強光照射紅色毛癬菌之后第1天、第3天、第7天的菌落直徑與陰性對照組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，顯示本文所用的能量密度585nm脈沖強光對菌落的生長無明顯抑制作用。見圖4。

表1 不同激光設(shè)備的參數(shù)

表2 紅色毛癬菌在不同激光照射后產(chǎn)生的角蛋白酶活性比較

注：*表示與未照射組比P<0.05

圖1Q開關(guān)Nd: YAG 532nm激光對紅色毛癬菌菌落生長的作用圖2Q開關(guān)Nd: YAG 1064nm激光對紅色毛癬菌菌落生長的作用圖3長脈寬Nd: YAG 1064nm激光對紅色毛癬菌生長的作用圖4585nm脈沖強光對紅色毛癬菌生長的作用

Fig.1Effect of Q-switched Nd: YAG 532nm laser on the colony diameter ofTrichophytonrubrumat different energiesFig.2Effect of Q-switched Nd: YAG 1064nm laser on the colony diameter ofTrichophytonrubrumat different energiesFig.3Effect of long pulse width Nd: YAG 1064nm laser on the growth ofTrichophytonrubrumFig.4Effect of long pulse width 585nm intense pulsed light on the growth ofTrichophytonrubrum

3 討 論

紅色毛癬菌是引起甲真菌病最常見的病原菌。相比于藥物，激光治療幾乎可以用于所有類型的患者，沒有系統(tǒng)副作用，并且能避免耐藥菌株的出現(xiàn)。既往研究資料表明高能量激光能有效治療甲真菌病[7]，但低能量激光是否有類似作用尚不清楚。我們知道，低能量激光可能通過光激發(fā)效應(yīng)對光敏感細胞產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng)，而不出現(xiàn)熱損傷。而高能量激光則通過熱效應(yīng)等損傷靶細胞活性,故如果低能量激光能達到殺死靶細胞從而抑制真菌生長,則治療上更為方便。本研究中，我們用不同類型的激光器，不同的能量密度對紅色毛癬菌進行照射，探討不同能量不同激光對紅色毛癬菌的作用。Nd: YAG激光是目前市面上比較常用的激光設(shè)備，臨床研究發(fā)現(xiàn)它對甲真菌病有較好的療效[8]。但脈寬、波長等參數(shù)是否也對菌落的抑制有不同的影響。因此我們嘗試了不同脈寬(調(diào)Q和長脈寬)激光以及不同波長(1064nm和532nm)的激光。我們對脈沖強光波長的選擇依據(jù)是，紅色毛癬菌中的主要色素成分黃麥格霉素，對波長532～589 nm激光吸收較好[9]。本研究顯示不同激光對紅色毛癬菌生長影響不同：2～4J/cm2能量Q開關(guān)Nd: YAG 532 nm激光、4～8J/cm2能量Q開關(guān)Nd: YAG 1064 nm激光、4J/cm2長脈寬Nd: YAG 1064 nm激光對體外培養(yǎng)的紅色毛癬菌有明顯抑制作用。這與部分國外學(xué)者研究結(jié)果一致[10]。

Q開關(guān)Nd：YAG激光對真菌菌落的抑制作用很可能是由于非特定的熱損傷以外的機制。532 nm Q開關(guān)Nd：YAG激光很好地被紅色色素基團吸收，而紅色毛癬菌正好含有豐富的黃麥格霉素，黃麥格霉素的存在使紅色毛癬菌培養(yǎng)中顯示紅色。這種紅色發(fā)色團的存在可以解釋紅色毛癬菌對532 nm激光的敏感性。

眾所周知，38～47J/cm2的695～1000 nm波長范圍的IPL系統(tǒng)和8～14 J/cm2的585 nm脈沖染料激光可以誘導(dǎo)明顯熱損傷[11]。本實驗中585 nm激光對紅色毛癬菌無明顯生長抑制作用，提示該抑制作用可能主要是色素相關(guān)光熱解的作用，而不是非特異性熱損傷作用。盡管Q開關(guān)Nd：YAG 1064 nm波長超出了黃麥格霉素的吸收光譜，我們卻觀察到Q開關(guān)Nd：YAG 1064 nm對紅色毛癬菌有類似的抑制作用。這可能是由于另一種色素基團，即紅色毛癬菌細胞壁中含有的黑色素基團被1064 nm波長所吸收。

除了波長以外，Q開關(guān)Nd：YAG激光另一個重要特征是脈沖相對較短。這些短脈沖(納秒級)會誘發(fā)微空化和聲波沖擊波，從而抑制真菌菌落。短脈沖時間(比熱馳豫時間短得多)通過快速加熱和冷卻也會引起目標(biāo)基團的熱損傷。這些激光以相對長的脈沖傳遞時，不會發(fā)生極端的熱循環(huán)和沖擊波。國外學(xué)者使用2940 nm波長的 Er: YAG激光進行類似研究，未發(fā)現(xiàn)其對紅色毛癬菌的生長抑制作用[10]。這可能提示了菌落抑制作用與非特異性熱損傷或含水量無關(guān)。

角蛋白酶是紅色毛癬菌侵入指趾甲的重要毒力因素[12]。有研究表明，指、趾甲作為底物誘導(dǎo)，能明顯刺激紅色毛癬菌產(chǎn)生角蛋白酶[13]。我們利用這一特性，用健康人甲作為誘生物，觀察不同激光照射后紅色毛癬菌產(chǎn)生角蛋白酶的改變情況。我們結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中高能量Q開關(guān)Nd: YAG 532 nm激光和Q開關(guān)Nd: YAG 1064 nm以及高能量長脈寬Nd: YAG1064 nm激光照射紅色毛癬菌后，其角蛋白酶的產(chǎn)生明顯受抑制。這提示激光可能通過降低角蛋白酶活性而達到抑制紅色毛癬菌生長的作用。但更多的可能機制有待更多的研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)中高能量組的Q開關(guān)Nd: YAG 532 nm激光、Q開關(guān)Nd: YAG 1064 nm激光和高能量長脈寬Nd: YAG 1064 nm激光能明顯抑制紅色毛癬菌的生長及角蛋白酶的活性，后續(xù)將會篩查療效更佳的激光設(shè)備及參數(shù)，同時將進一步探討激光治療甲真菌病可能的分子機制，為甲真菌病的治療提供更多的選擇方案。