李首道，涂鳳琴，陳燁超，陳丹，盧躍鵬，康翠欣，何麗姍

（武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，湖北武漢430012）

近年來，奶粉的質(zhì)量問題越來越受到國家的重視，也在全世界范圍內(nèi)引起了廣泛關(guān)注。而嬰幼兒配方奶粉中激素類藥物的殘留量也已經(jīng)成為社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)問題。地塞米松作為一種糖皮質(zhì)激素除了治療功能外[1-3]，還有著提高飼料的轉(zhuǎn)化率，增加動(dòng)物體重等功效，其在食品鏈的殘留也受到大家的關(guān)注。地塞米松能夠降低人體的免疫功能，長(zhǎng)期食用含有激素的奶粉易誘發(fā)感染并且可通過抑制生長(zhǎng)激素的分泌而導(dǎo)致負(fù)氮平衡，使兒童的生長(zhǎng)發(fā)育受到影響。另外，糖皮質(zhì)激素容易引起消化系統(tǒng)并發(fā)癥及某些精神病癥狀，例如神經(jīng)性過敏、失眠等[4-10]。目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道嬰幼兒配方乳粉中地塞米松的檢測(cè)方法。孫清榮等[11]采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)雞肉中的氯霉素和地塞米松；馬育松等[12]采用液相色譜－質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定牛奶和奶粉中地塞米松殘留量。本文采用甲酸乙腈溶液提取，固相萃取小柱凈化，建立了簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定奶粉中地塞米松的方法，為我國的嬰幼兒配方乳粉的檢測(cè)提供一定的技術(shù)支撐[13-20]。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨均為色譜純：默克公司；冰乙酸為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；地塞米松標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度≥99.0%，德國 Dr.Ehrenstorfer 公司；0.2%甲酸-乙腈溶液：量取乙腈500 mL，加入甲酸2 mL，用乙腈定容至 1 000 mL；Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱：200 mg/6 mL。

1.2 儀器

AB SCIEX 4500 Qtrap 串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：美國AB 公司，配有電噴霧離子源（ESI）；Milli-Q 超純水器：美國Millipore 公司；PM5-2000TL 型超聲波清洗儀：普律瑪儀器公司；Vortex－Genie 2 渦旋混勻器：美國Scientific Industries 公司；N－EVAP111 氮?dú)鉂饪s儀：美國Organomation Associates Jnc 公司 ；Allegra 64R Cen －trifuge 低溫冷凍離心機(jī)：美國Beckman 公司，轉(zhuǎn)速不低于12 000 r/min。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg 的地塞米松對(duì)照品于10 mL容量瓶中，用少量50%乙腈水溶液溶解，再用乙腈定容至刻度，配成濃度為1.0 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃下保存。

1.4 儀器測(cè)定條件

1.4.1 超高效液相色譜條件

Waters XBridge C18 柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：3 μL；流速：0.3 mL/min。流動(dòng)相 A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：乙腈。梯度洗脫程序：0～1.5 min，10 % B；1.5 min～4 min，10 %～80 % B；4 min～6.8 min，80%B；6.8 min～6.9 min，80%～10%B；6.9 min～8.0 min，10%B。梯度洗脫程序見表1。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：Turbo V ESI 源；掃描模式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）采集模式；電噴霧電壓（IS）：5 000 V；霧化氣壓力（GS1）：50 psi；輔助氣壓力（GS2）：50 psi；氣簾氣壓力 （CUR）：35 psi；碰撞氣（CAD）：7 psi；離子源溫度（TEM）：450 ℃；質(zhì)譜分析優(yōu)化參數(shù)見表2。

表1 超高效液相色譜梯度洗脫條件Table 1 Ultrahigh performance liquid chromatography gradient elution conditions

表2 地塞米松的定性離子、定量離子、去簇電壓和碰撞能量Table 2 Mass spectrometric parameters of dexamethasone

1.5 樣品前處理

1.5.1 提取

稱取1 g（精確到0.001 g）試樣于 50 mL 塑料離心管內(nèi)，加入2 mL 水溶解樣品，再加入5 mL 0.2%甲酸乙腈溶液，渦旋混勻10 s，超聲提取30 min，4 ℃下10 000 r/min 離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50 mL離心管內(nèi)。殘?jiān)侔瓷鲜霾襟E提取一次，合并上清液，待凈化。

1.5.2 凈化

將上述提取液全部過Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱，收集全部流出液，40 ℃氮吹濃縮至近干，用1.0 mL 初始流動(dòng)相溶液溶解，加入2 mL 正己烷除脂，4 ℃下10 000 r/min 離心5 min，棄去正己烷層，將剩余溶液過0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜，高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理凈化柱的選擇

分別考察了C18 柱、硅膠柱、Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱的凈化效果。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)地塞米松在C18、硅膠柱上均有保留，且回收率超過80%，但都需要采用不同的活化溶液和洗脫溶液。而Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱不僅能選擇性地吸附奶粉中的磷脂等非極性干擾物同時(shí)不吸附目標(biāo)化合物，其通過式的凈化方式能極大地提高樣品分析的通量和效率，節(jié)約溶劑和時(shí)間。經(jīng)比較，選取Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱為本試驗(yàn)的前處理小柱。

2.2 提取溶液的選擇

奶粉樣品中含有蛋白質(zhì)、磷脂等親脂性雜質(zhì)以及碳水化合物等，這些雜質(zhì)都會(huì)對(duì)目標(biāo)物的分析造成干擾，且蛋白質(zhì)和磷脂不易電離，會(huì)污染儀器，給奶粉中低含量水平的地塞米松分析帶來了挑戰(zhàn)。此次試驗(yàn)分別考察了丙酮、乙腈、0.2%甲酸-乙腈、乙酸乙酯溶液作為提取溶液的提取效果，試驗(yàn)結(jié)果表明：以0.2%甲酸-乙腈溶液作為提取溶劑時(shí)，目標(biāo)化合物干擾物質(zhì)少，色譜峰型對(duì)稱，響應(yīng)值較高，故選用其作為提取溶液。地塞米松的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖、空白基質(zhì)溶液色譜圖、空白基質(zhì)加標(biāo)溶液色譜圖、不同提取溶劑條件下地塞米松的回收率比較圖以及地塞米松標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子色譜圖，分別見圖1、圖 2、圖3、圖 4、圖 5 和圖6。

圖1 地塞米松標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 The chromatogram for dexamethasone standard

圖2 奶粉空白基質(zhì)溶液色譜圖Fig.2 Blank matrix solution chromatogram of milk powder

圖3 奶粉空白基質(zhì)加標(biāo)溶液色譜圖Fig.3 Blank matrix of milk powder with standard solution chromatogram

圖4 在不同提取溶劑條件下地塞米松的回收率比較Fig.4 Comparison of the recovery of dexamethasone in different solvent extraction conditions

圖5 地塞米松標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子色譜圖Fig.5 Extracted ion chromatograms of dexamethasone in standard solution

圖6 地塞米松標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子色譜圖Fig.6 Extracted ion chromatograms of dexamethasone in standard solution

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)地塞米松的分子結(jié)構(gòu)，質(zhì)譜離子源的電離模式應(yīng)采用正離子模式。將100 ng/mL 的目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液通過針泵直接注入質(zhì)譜，以優(yōu)化噴霧電壓、碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)，確定選擇表2 所示離子對(duì)進(jìn)行定性、定量分析。

2.4 線性范圍和檢出限

分別取空白奶粉樣品按照1.5 中試驗(yàn)步驟制備空白基質(zhì)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用空白基質(zhì)溶液稀釋成濃度分別為 0、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)系列，按照上述色譜條件。以所得峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（C，ng/mL）進(jìn)行線性回歸分析，得到地塞米松的回歸方程，見表3。

結(jié)果表明，地塞米松在0～20 ng/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999。采用在空白基質(zhì)中加標(biāo)的方法，依據(jù)色譜峰的信噪比（S/N）大于3 倍確定檢出限（detection limit，LOD），S/N 大于 10 倍確定定量限（Limit of quantitation ，LOQ），得到奶粉中的地塞米松的檢出限為 1.0 μg/kg，定量限為 3.0 μg/kg。

表3 線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear range，linear regression equation and correlation coefficient

2.5 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

分別取空白奶粉樣品按照1.5 中試驗(yàn)步驟，進(jìn)行準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 奶粉中地塞米松的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Standard recovery and relative standard deviation of dexamethasone in milk powder（n=6）

由表4 可見，在不同的加標(biāo)濃度下地塞米松的回收率為90.7%～98.9%，方法的精密度為3.1%～6.5%，表明方法具有較好的回收率及穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

目前，國內(nèi)外關(guān)于奶粉中地塞米松的檢測(cè)文獻(xiàn)較少。本文建立了奶粉中地塞米松的高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定方法。樣品經(jīng)甲酸乙腈溶液超聲提取，經(jīng)Oasis PRiME HLB 固相萃取柱凈化后上樣。該方法操作簡(jiǎn)單高效，重現(xiàn)性較好，適用于奶粉中地塞米松含量的測(cè)定，為確保我國的食品安全提供一定的技術(shù)支撐作用。