廖艷華
(廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心,廣西南寧530028)
β-受體激動劑是一類母核為β-苯乙醇胺結(jié)構(gòu)、具有舒張平滑肌及解除支氣管痙攣等作用的藥物,在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療支氣管哮喘。該類藥物能結(jié)合細(xì)胞膜中的β-受體,從而發(fā)生一些列生理效應(yīng),減少脂肪沉積,提高瘦肉率[1-2],導(dǎo)致畜禽肉中該類藥物殘留嚴(yán)重超標(biāo)。由于β-興奮劑作用效應(yīng)較強(qiáng),并且在動物體內(nèi),特別是在動物肝、腎、肺殘留量最高,通過食物鏈進(jìn)入人體,會使一些易感人群產(chǎn)生較明顯的中毒癥狀,嚴(yán)重危害人類健康[3-4]。為保證動物性食品衛(wèi)生安全,我國農(nóng)業(yè)部已明令[5-6]克倫特羅及其鹽、沙丁胺醇及其鹽、西馬特羅及其鹽等β-受體激動劑為禁止使用藥物,不得在所有動物性食品中檢出,并制定了相應(yīng)的監(jiān)管制度與檢測方法[7-12]。
β-受體激動劑大多含苯乙醇胺骨架,按苯環(huán)取代基不同可分為與胺基、酚羥基、鹵素等各種取代基鏈接;根據(jù)胺基上的取代基不同,可分為叔丁基或異丙基類興奮劑,這有利于β-受體激動劑裂解途徑及機(jī)理分析、其二級質(zhì)譜豐富的特征離子碎片信息更有利于目標(biāo)物的篩查、確證。在國內(nèi)最常用的有克倫特羅、沙丁胺醇、特布他林等。
β-受體激動劑化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。
圖1 β-受體激動劑化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structural of β-agonist
β-受體激動劑常見種類及特征基團(tuán)見表1。
β-受體激動劑的檢測方法包括依據(jù)其不同樣品基質(zhì)前處理方法和檢測儀器的不同,目前已建立了液相色譜、酶聯(lián)免疫法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometer,GC/MS)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-mass spectrometer HPLC-MS/MS),由單組分檢測逐漸向多組分同時檢測發(fā)展,靈敏度也逐步提高。
表1 β-受體激動劑常見種類及特征基團(tuán)Table 1 Common species and characteristic groupsof β-agonist
目前現(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T5009.192-2003《動物性食品中克倫特羅殘留量的測定》[12]第一法為液相色譜法,此法僅為單個組分克倫特羅的檢測,試樣剪碎后用高氯酸勻漿,進(jìn)行超聲加熱提取后,用異丙醇 ∶乙酸乙酯=40 ∶60(v/v)萃取,有機(jī)相濃縮,經(jīng)弱陽離子交換柱進(jìn)行分離,用乙醇∶氨=98 ∶2(v/v)溶液洗脫,洗脫液經(jīng)流動相定容后在高效液相色譜儀上紫外檢測器進(jìn)行測定,外標(biāo)法定量,檢出限為0.5 ug/kg。王爍等[13]建立了超高效液相色譜測定豬組織中4 種β-興奮劑(奧西那林、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺)的方法,流動相采用乙腈和0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液的梯度洗脫,檢測波長為227 nm,外標(biāo)法定量,4 種興奮劑的檢出限為 0.1 μg/kg~0.4 μg/kg,不同加標(biāo)水平回收率為61.2%~101.3%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.9%~9.2%,此法在分離能力、分析速度及靈敏度方面都比高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)有較大提高,二極管陣列檢測器(photo-diode array,PDA)可以提供 190 nm~400 nm 波長的吸收曲線圖,在保留時間定性基礎(chǔ)上再結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與樣品中待測物吸收曲線匹配度定性。但高效液相法依然存在靈敏度低、無法同時進(jìn)行多種興奮劑的測定等缺點,而且存在較多雜質(zhì)干擾,給定性確證帶來困難,因此在近些年應(yīng)用得很少。
免疫分析法是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合為基礎(chǔ)檢測各種物質(zhì)的分析方法,由于免疫法選擇性較好,具有前處理簡單、靈敏度高等優(yōu)點,故在快速篩查大批量樣品中獸藥殘留方面有廣泛應(yīng)用,免疫分析法中最常用的是酶免疫分析法和膠體金免疫層析法。
酶免疫分析法其原理是待測樣品中的β-受體激動劑類藥物殘留與微孔包被的抗原共同競爭特異性抗體。萬宇平等[14]應(yīng)用直接競爭酶聯(lián)免疫吸附技術(shù),建立了一種快速檢測動物組織中β-興奮劑類藥物多殘留的方法,并對其技術(shù)性能進(jìn)行了評價。結(jié)果表明,該方法的IC50動范圍為0.4 μg/L~0.7 μg/L,對組織樣本的檢測限為0.5 μg/kg;樣本添加回收率為72.9%~103.5%,變異系數(shù)為5.8%~14.1%;可用于檢測克侖特羅、沙丁胺醇等8 種β-受體激動劑。張璐琪等[15]用比較了3 種不同公司生產(chǎn)的試劑盒測定3 種β-興奮劑殘留,結(jié)果顯示鹽酸克倫特羅試劑盒和萊克多巴胺試劑盒的檢出結(jié)果與液質(zhì)法的符合率較高,均為94%;沙丁胺醇試劑盒和β-興奮劑試劑盒的符合率一般,分別為76.2%和75%,主要表現(xiàn)在假陽性結(jié)果較多。龔倩等[16]建立了快速檢測豬肉中克倫特羅、沙丁胺醇、溴布特羅和特布他林4 種β-受體激動劑的光激化學(xué)發(fā)光納米均相時間分辨熒光免疫(alpha LISA)分析方法,沙丁胺醇與克倫特羅、溴布特羅和特布他林的交叉反應(yīng)率分別為143.3%、179.2%和95.6%,檢出限為0.03 ng/mL~0.08 ng/mL,在 0.5、10、20 μg/kg 3 個添加水平下,4 種化合物的平均回收率為82.5%~15.9%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于12.0%。
膠體金免疫層析法是一種利用膠體金顆粒作為標(biāo)記物簡單快速的免疫分析方法[17]。其最關(guān)鍵的是制備出特異性強(qiáng)和純度高的單克隆抗體,使用原理是將人工合成的抗原先固定于條狀纖維層析材料的試紙條上,膠體金標(biāo)記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結(jié)合墊上,樣品溶液借助毛細(xì)作用在試紙條上移動,待測物與人工合成的抗原競爭結(jié)合膠體金標(biāo)記的抗體,并直接以顏色顯示檢測結(jié)果。目前主要用在液體樣品檢測中,在肉制品中應(yīng)用不多,其靈敏度和準(zhǔn)確度不及酶聯(lián)免疫法。
現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)免疫方分析法[18-19]主要是飼料和動物尿液中受體激動劑的酶聯(lián)免疫試劑盒方法。GB/T 5009.192-2003《動物性食品中克倫特羅殘留量的測定》第三法為酶聯(lián)免疫法。
雖然免疫法操作簡單,使用成本不高,在監(jiān)測檢測中能快速測量大批量樣品,但免疫學(xué)存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象仍然是制約其應(yīng)用的主要問題,而且受廠家生產(chǎn)試劑質(zhì)量影響,有可能抗體批次不同,測定結(jié)果也會出現(xiàn)差異。另外在同類藥物多殘留檢測方法方面也有其不能所及之處,不能用于國家相關(guān)執(zhí)法仲裁檢驗。
色譜聯(lián)用技術(shù)即兩種或兩種以上的分析技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用,以達(dá)到更好的分析效果。色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)一方面具有色譜的分離能力、分析速度和靈敏度,又兼具質(zhì)譜對化合物的結(jié)構(gòu)的定性能力,因而在檢測的選擇性和準(zhǔn)確度上都有更好表現(xiàn)。色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是目前分析β-受體激動劑殘留的主流方法,包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)。我國現(xiàn)行檢驗方式依據(jù)不同樣品基質(zhì)前處理方法及檢測儀器制定,對 GC-MS[10,12]和 HPLC-MS[7,8,9,11]檢測方法做了相關(guān)規(guī)定和闡述。
受體激動劑的GC/MS 分析與其他分析方法不同主要是樣品需衍生化,因為β-受體激動劑屬于高沸點、難揮發(fā)的極性化合物,不適合直接進(jìn)行GC 或GCMS 分析。通過衍生化,不僅可以增大試樣的揮發(fā)性和穩(wěn)定性,減小樣品的極性,還可以達(dá)到改善分析效果、提高靈敏度的目的。衍生反應(yīng)的類型目前文獻(xiàn)報道的主要有3 類:第一類為?;磻?yīng),衍生劑通常為七氟乙酰酐、乙酸酐;第二類為甲基硼酸或丁基硼酸化反應(yīng),利用β-受體激動劑結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈上有-OH 和-NH-與衍生試劑形成五元環(huán),由于硼的同位素為很強(qiáng),故其衍生物的質(zhì)譜峰很有特征性。第三類采用硅烷化反應(yīng),衍生劑通常為雙三甲基硅基三氟乙酰胺(bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide,BSTFA)+1 %(φ)三甲基氯硅烷(trimethyl chlorosilane,TMCS)衍生,最后一種是最常用的衍生劑。報道的相關(guān)文獻(xiàn)[20-23]和標(biāo)準(zhǔn)方法[10,12]GC-MS 樣品前處理大多都是樣品經(jīng)過酶解或酸解之后,用pH5.2 的乙酸鈉緩沖溶液或酸性甲醇或高氯酸溶液提取樣品中的獸藥殘留,經(jīng)高氯酸沉淀蛋白后,堿性條件下經(jīng)過乙酸乙酯 ∶異丙醇(60 ∶40,v/v)進(jìn)一步提取凈化、濃縮,在pH5.2 緩沖體系下經(jīng)固相萃取柱凈化,最后衍生經(jīng)GC-MS 內(nèi)標(biāo)法定量測定;劉五一等[24]用氣質(zhì)法測定畜禽肉中4 種β-興奮劑的前處理新技術(shù)進(jìn)行研究,結(jié)果表明直接用5%的高氯酸提取,WCX 陽離子交換固相萃取小柱效果最佳,檢測的4 種興奮劑在 50 μg/L~1 000 μg/L 的范圍具有良好線性,加標(biāo)回收率在84.32 %~103.15 %之間,RSD 在1.35%~4.78%之間。岳韓笑等[25]采用同位素稀釋質(zhì)譜法,結(jié)合HLB-MCX 雙柱固相萃取技術(shù),建立了豬肉中克倫特羅、妥布特羅、溴布特羅、沙丁胺醇等4 種β-受體激動劑殘留量的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)檢測方法,方法最低檢測限為0.13 μg/kg~0.40 μg/kg,最低定量限為0.40 μg/kg~1.27 μg/kg。由于這種方法衍生耗時長,條件不好控制,同時能檢測的受體激動劑不是很多,因此方法的使用在逐年減少。
相比于GC-MS、HPLC-MS/MS 的前處理相對簡單,不需要經(jīng)過衍生化步驟,因此國內(nèi)得到快速普及,現(xiàn)行主流的適用于動物源性β-食品受體激動劑的LC/MS/MS 國家標(biāo)準(zhǔn)分析方法只要有3 個,分別是GB/T 21313-2007 《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》、農(nóng)業(yè)部1025 號公告-18-2008《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、GB/T 22286-2008《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》。
表2 3 種現(xiàn)行β-受體激動劑國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法比較Table 2 Comparison of national standard methods of 3 β-agonist
表2 列舉了3 種國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法的檢驗步驟及定量方式對比發(fā)現(xiàn),3 種方法的標(biāo)準(zhǔn)分析方法各有優(yōu)缺點,GB/T 21313-2007《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》的檢驗方法能測定8 種β-受體激動劑,提取液不用調(diào)節(jié)pH 值可直接凈化,但是本法需經(jīng)雙柱凈化,兩次溶劑揮干,檢測成本高,過程耗時;基質(zhì)外標(biāo)法定量檢測結(jié)果受檢驗人員操作影響較大;不同類型的食品其基質(zhì)效應(yīng)也不一樣,針對分析樣品的基質(zhì)還需配制不同基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,增大了檢驗工作量;農(nóng)業(yè)部1025 號公告-18-2008 檢驗方法能測定9 種β-受體激動劑中,用一步液液萃取代替固相萃取凈化,雖然節(jié)省檢測成本,但需調(diào)節(jié)pH 值,人員勞動強(qiáng)度增大,大量溶劑的揮干容易對環(huán)境產(chǎn)生污染,同樣也存在基質(zhì)外標(biāo)法定量無法準(zhǔn)確等缺點;GB/T 22286-2008《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》檢驗方法能測定11 種β-受體激動劑,采用基質(zhì)內(nèi)標(biāo)稀釋法定量模式,能減少因為樣品提取、質(zhì)譜進(jìn)樣和離子化等多因素造成的差異,定量結(jié)果更準(zhǔn)確,但液液提取時用的提取溶劑為異丙醇∶乙酸乙酯=60 ∶40(v/v),由于異丙醇在提取液中的比例高、沸點高,其在揮干中需要耗費大量時間,如完全按國標(biāo)方法操作,異丙醇 ∶乙酸乙酯=60 ∶40(v/v)揮干至少需要 4 h,這給檢測過程造成了很大的困擾。
近些年對于液質(zhì)聯(lián)用法檢測β-受體激動劑,大多學(xué)者研究的方向集中在樣品的前處理技術(shù)與儀器多殘留檢測技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用上,能同時分析11 種~35 種受體激動劑。前處理研究的重點主要集中在樣品水解方式的選擇及凈化方法的優(yōu)化上。賈玉珠等[26]和蔡增軒[27]建立了超高效液相色譜一電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法檢測動物組織中20 種β-興奮劑殘留,20 種β-興奮劑殘留用3 種同位數(shù)內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。受體激動劑在55 ℃經(jīng)葡萄糖苷酸酶酶解2 h,此酶解方式較傳統(tǒng)或國標(biāo)37 ℃酶解16 h 節(jié)省了很多時間。劉先軍等[28]用1 %三氯乙酸溶液超聲提取15 min 動物組織中26 種β-受體激動劑,認(rèn)為此酸水解的方式起到了水解軛合物的作用,同時具有提取待測物、沉淀蛋白蛋白功能,相對酶解方比較,減少了酶水解中酶制劑本身及其酶解產(chǎn)物對目標(biāo)物的干擾,滿足快速檢測化的要求。凈化方式優(yōu)化研究方向主要集中在固相萃取技術(shù)上,張瑞雨等[29]優(yōu)化了樣品前處理方法,應(yīng)用于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法檢測豬肉、豬肝中萊克多巴胺、沙丁胺醇β-受體激動劑。沙丁胺醇和萊克多巴胺的檢出限分別為0.13、0.14 μg/kg,在不同基質(zhì)濃度下的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.9%~16.2%和6.4%~20.2%。該方法與GB/T 22286-2008《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》的預(yù)處理方法比較,使用鹽酸代替高氯酸調(diào)節(jié)pH2.0,達(dá)到沉淀蛋白與樣品過柱凈化前調(diào)節(jié)pH 值雙重效果,凈化樣品時減少了有機(jī)溶劑的使用,用價格稍低的SCX 凈化柱代替MCX 凈化柱,洗脫液用5%氨化乙酸乙酯代替5%氨化甲醇,節(jié)約了成本,提高了檢驗效率,減少了工作量。馬俊美等[30]建立在線固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉和羊肉中10 種β-受體激動劑的全自動分析方法,樣品經(jīng)MCX在線固相萃取小柱凈化,XBridge C18色譜柱分離,檢出限為 0.004 μg/kg~0.040 μg/kg;方法回收率為 76.5%~107.7%,在線固相萃取提高了樣品的自動化程序,保證了方法重現(xiàn)性,提高工作效率。
除了傳統(tǒng)的液液萃取與離子交換固相萃取的凈化模式,張學(xué)亮等[31]建立了一種分子印跡固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定豬肉中5 種β-受體激動劑殘留的方法,檢出限為 0.005 μg/kg~0.009 μg/kg,添加水平為 0.25、1、5 μg/kg 時,回收率為 80.4%~92.9%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%~6.3%。史娜等[32]建立MPI 固相萃取-同位素稀釋法-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定動物源性食品中35 種β-受體激動劑和11 種β-受體阻斷劑殘留的方法,前處理方法大多與GB/T 22286-2008《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》雷同,不同之處是液液萃取的異丙醇 ∶乙酸乙酯比例為 1 ∶1(v/v),用 MPI 固相萃取代替MCX 固相萃取,由于檢測數(shù)目較多,用的內(nèi)標(biāo)多達(dá)10 種,保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。羅輝泰等[33]建立了分散固相萃取-同位素稀釋-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(dSPE-ID-HPLC-MS/MS)同時測定豬肉中26 種β-受體激動劑殘留的方法,樣品經(jīng)酶解、乙酸銨緩沖液提取、高氯酸沉淀蛋白、離心后,調(diào)節(jié)pH9.0,乙腈反萃取后經(jīng)凈化上機(jī)測定。檢出限分別為0.03 μg/kg~0.1 μg/kg,在3 個不同濃度的添加水平下,平均回收率為65.3%~108.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%~13.3%,通過同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正后其回收率能滿足殘留分析檢測要求,該方法成本低,不用經(jīng)過復(fù)雜的固相萃取步驟,大大縮短了樣品前處理時間。李磊等[34]建立QuEChERS EMR-Lipid 為前處理技術(shù)測定動物源性食品中8 種β-受體激動劑,樣品經(jīng)酶解、離心處理后,先后經(jīng)過增強(qiáng)型脂質(zhì)快速凈化管(QuEChERS EMR-Lipid)、脂質(zhì)凈化反萃取管(QuEChERS Final Polish EMRLipid)凈化后上LC-MS/MS 分析測定,8 種組分的檢出限范圍為0.2 μg/kg~0.4 μg/kg,加標(biāo)回收率為 79.1%~94.8%。
近年來隨著檢測儀器的發(fā)展,基于高分辨質(zhì)譜可以測定化合物的精確相對分子量,對樣品進(jìn)行高靈敏度、高質(zhì)量精度的全掃描分析,對復(fù)雜樣品中目標(biāo)化合物的檢測具有明顯優(yōu)勢。因此成為近年動物源性食品中高通量獸藥殘留篩查與確證研究的熱點,劉暢等[35]建立豬肉中31 種β-受體激動劑的高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF-MS)檢測方法,31 種化合物的檢出限為 0.01 μg/kg~5 μg/kg,結(jié)合自建的精確相對分子質(zhì)量數(shù)據(jù)庫,通過比較精確相對分子質(zhì)量、保留時間、同位素峰以及特征碎片離子等信息,進(jìn)行篩選檢測,適合于動物源性食品中可能存在的β-受體激動劑的篩查。
激動劑其他檢測方法還有毛細(xì)管電泳法[36]、生物傳感器法,但這些方法目前不是特別的完善法,實際工作中很少用到,存在各自的缺點,需要進(jìn)一步研究。
通過研究發(fā)現(xiàn),HPLC-MS/MS 依然是動物源性食品中定性定量分析檢測的主要手段,但由于不同食品基質(zhì)的復(fù)雜,前處理步驟多、耗時長以及分析存在較強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)的影響,其方法靈敏度、精密度及基質(zhì)效應(yīng)的大小受技術(shù)人員操作影響較大,因此,對于β-激動劑的殘留檢測,仍需從4 個方面著手:1、加快現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)的整合、補(bǔ)充和完善。由于現(xiàn)行的多個國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法存在著部分交叉、重合,涉及的檢測項目種類為19 種,也沒有完全涵蓋國家相關(guān)法規(guī)或制度所羅列的全部項目,無法保證相關(guān)法規(guī)的有效實施;2、為了滿足食品安全風(fēng)險監(jiān)測檢測技術(shù)高通量、快速化分析技術(shù)要求,待測物提取和凈化步驟的改進(jìn)依然是未來今年研究熱點,因此認(rèn)為未來更有效、更簡化的凈化模式是前處理研究的重點,其中最能實現(xiàn)該目標(biāo)的前處理方法認(rèn)為是QUEChERS 和SPE 技術(shù),這兩種技術(shù)的優(yōu)勢都包括低試劑消耗及高通量,雖然QUECh-ERS 技術(shù)主要針對提取液中的雜質(zhì),凈化效果不及傳統(tǒng)SPE,但筆者認(rèn)為它在低試劑消耗、高通量的多殘留篩查方面仍有明顯優(yōu)勢。3、三重四極桿質(zhì)譜有很高的靈敏度,很好的線性范圍,對于監(jiān)控目標(biāo)物是非常有效的利器。但是近些年,發(fā)生食品安全問題的往往是那些不在監(jiān)控清單中的物質(zhì),食品安全未知物監(jiān)控領(lǐng)域?qū)⑹俏磥淼募夹g(shù)發(fā)展方向,因此更有效的質(zhì)譜掃描模式及其分析軟件、飛行時間和軌道阱等高分辨質(zhì)譜對低殘留樣品的定性定量、多殘留篩查以及物質(zhì)精確質(zhì)量數(shù)的測定和化合物結(jié)構(gòu)研究方向方面提供更為有力的檢測工具。4、由于精密儀器價格昂貴、試劑耗材用量大、檢測過程復(fù)雜、技術(shù)要求高、檢測時間長等因素,因此建立特異性強(qiáng)、靈敏度高免疫分析快速篩查方法可有效提高檢驗效率,在現(xiàn)場監(jiān)控和大規(guī)模篩選檢測中仍有廣闊的應(yīng)用前景。