唐素婷，區(qū)錫敏，孫張樂，黃桂東，婁華，鐘先鋒，*

（1.佛山科學技術(shù)學院食品科學與工程學院，廣東佛山528231；2.廣東省傳統(tǒng)發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，廣東佛山528231；3.廣東省食品流通安全控制工程技術(shù)研究中心，廣東佛山528231；4.佛山市釀造工程技術(shù)研究中心，廣東佛山528231；5.佛山農(nóng)業(yè)生物制造工程技術(shù)研究中心，廣東佛山528231；6.佛山科學技術(shù)學院生命科學與工程學院，廣東佛山528231）

醬油渣，又稱為醬渣，是指醬油制作過程中產(chǎn)生的殘渣。據(jù)統(tǒng)計，2016年我國醬油產(chǎn)量達 1 000 萬噸[1-2]，按照醬油與醬油渣1 ∶0.67 的產(chǎn)出比例，醬油渣年產(chǎn)量接近700 萬噸。由于醬油渣水分含量高，不易貯存，如不及時處理，會造成環(huán)境極大負擔[3]。醬油渣富含粗蛋白[4-5]、粗纖維[6-7]、粗脂肪等物質(zhì)[8-10]，用作飼料是其綜合利用的主要途徑之一[11]，但是醬油渣含鹽量高，過量喂養(yǎng)容易導致動物中毒，加之其富含粗纖維，適口性較差，導致醬油渣飼料化應用受到一定程度的制約。利用特定的微生物再次發(fā)酵醬油渣，能夠提高其營養(yǎng)價值以及改善其理化性質(zhì)，可有效解決上述問題。醬油渣的主要微生物涉及曲霉、酵母菌及乳酸菌三大類[12-13]。乳酸菌能分解糖類物質(zhì)，產(chǎn)生乙酸、乳酸等有機酸，通過降低pH 值，抑制腐敗菌的生長[14-15]，增加醬油渣發(fā)酵產(chǎn)物的營養(yǎng)物質(zhì)含量。范志平等[16]對乳酸菌、巨大芽孢桿菌、醋酸菌和黑曲霉的菌株混合發(fā)酵醬油渣、秸稈等廢棄資源進行了研究，發(fā)現(xiàn)乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸，能夠?qū)㈦y溶性磷螯合生成可溶性磷鹽，有效地增加原料中的磷含量。王紅濤[17]研究證明，以源于醬油渣的乳酸菌和地衣芽孢桿菌發(fā)酵醬油渣，發(fā)酵后的飼料粗脂肪含量降低，粗蛋白含量有所提高，飼料品質(zhì)更高。目前，乳酸菌在飼料行業(yè)中的應用受到較多關(guān)注，但從醬油渣中分離乳酸菌應用于醬油渣發(fā)酵的研究則很少。本研究擬采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)手段從醬油渣中分離乳酸菌菌株，使用形態(tài)學、生理生化特征試驗和分子生物學結(jié)合的手段對其進行鑒定，并測定其生長曲線，以期為其應用于醬油渣發(fā)酵、改善醬油渣發(fā)酵品質(zhì)提供菌種資源，為醬油渣飼料化提供理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

醬油渣樣品：由廣東省某調(diào)味食品有限公司提供。

過氧化氫生化鑒定管、革蘭氏染色試劑盒、硫化氫生化鑒定管、吲哚生化鑒定管、明膠生化鑒定管、硝酸鹽（還原）生化鑒定管：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；MRS培養(yǎng)基（改良MRS 培養(yǎng)基基礎(chǔ)）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；碳酸鈣、氯化鈉、氫氧化鈉：天津市大茂化學試劑廠。

1.2 設(shè)備與儀器

電子分析天平（ME104）：梅特勒-托利多精密儀器公司；超凈工作臺（SW-CJ-1FD）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（LRH-150）：上海一恒科學儀器有限公司；全自動滅菌鍋（GR60DA）：致微（廈門）儀器有限公司；防凍霜冰箱（BCD-189WDPV）：海爾股份有限公司；顯微鏡（PH100）：鳳凰光學集團有限公司；微孔板分光光度計酶標儀（Epoch2）：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 醬油渣中乳酸菌的分離純化

無菌條件下，稱取醬油渣25 g 溶解于225 g 無菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline），渦旋儀上振蕩1 min，靜置30 min，吸取中層溶液，梯度稀釋法制成10-1至10-7共7 個濃度的稀釋液[18]。吸取各稀釋度溶液100 μL，使用無菌玻璃珠均勻涂布于含0.3%碳酸鈣的MRS 固體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h。挑取MRS 培養(yǎng)基中有典型溶鈣圈的菌落劃線于相應固體培養(yǎng)基，反復劃線純化至菌落一致[19]。挑取單菌落于 MRS 液體培養(yǎng)基中 37 ℃培養(yǎng) 12 h，與甘油 1 ∶1（體積比）混合保存于-20 ℃冰箱備用。同時劃線于MRS固體斜面培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h～36 h 至長出菌落，4 ℃冰箱保藏備用。

1.3.2 醬油渣中乳酸菌的鑒定

菌株的形態(tài)學觀察：將已純化的菌株劃線于固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄菌株的菌落形態(tài)。取菌株的菌落進行革蘭氏染色實驗，在顯微鏡下觀察菌株的菌體形態(tài)[20]。

菌株的生理生化實驗：參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[21]和華鶴良[22]的方法，桿狀菌株進行酶觸、硝酸鹽（還原）、明膠液化、硫化氫和吲哚試驗；球狀菌株進行酶觸、硝酸鹽（還原）、葡萄糖產(chǎn)氣試驗、6.5%NaCl 生長以及10、45 ℃生長試驗。具體實驗操作參考生化鑒定管的說明書。

乳酸菌株的分子生物學鑒定：將革蘭氏陽性的菌株活化2 次至穩(wěn)定期，低溫條件下送1 mL 菌液至北京六合華大基因科技有限公司進行菌株的DNA 提取、PCR 擴增及16S rRNA 序列測序。

系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：根據(jù)菌株的測序序列，登陸GenBank 中 BLAST 程序（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）比對，在EzBioCloud 查詢模式菌株信息[23]，整合建樹所需16S rRNA 信息，利用Mega5.0 軟件，采用鄰近算法，自展值（bootstrap 值）為 1 000 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[24]。

1.3.3 乳酸菌菌株生長曲線的測定

菌株活化三代至穩(wěn)定期，調(diào)節(jié)OD600nm=1±0.05，按照2%的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基，以不接種的MRS 液體培養(yǎng)基為陰性對照，37 ℃條件下培養(yǎng)至0、2、4、6、8、10、12、16、20，24、28、32、36、40 h，分別取出培養(yǎng)試管，利用酶標儀測定乳酸菌株的OD600nm值。以O(shè)D600nm值為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標繪制各菌株生長曲線[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬油渣中乳酸菌的菌落形態(tài)和生理生化試驗特征

本研究從醬油渣中分得到4 株乳酸菌，分別是HT4、HT102、HT160、HT197，菌落顏色為灰白或奶白色，中央凸起，菌落表面光滑有光澤，邊緣齊整。醬油渣中乳酸菌的菌落形態(tài)描述詳見表1。

表1 醬油渣中乳酸菌分離菌株菌落形態(tài)及其在顯微鏡下的菌體形態(tài)Table 1 The colony morphology and microscopic morphology of lactic acid bacteria isolated from soy sauce residue

部分乳酸菌菌體形態(tài)見圖1。

圖1 部分菌株在顯微鏡下的菌體形態(tài)（1 000 倍）Fig.1 Microscopic morphology under microscope of partial strains（1 000 times）

由表1 和圖1 知，經(jīng)革蘭氏染色試驗后鏡檢發(fā)現(xiàn)，4 株乳酸菌均為革蘭氏陽性菌，菌體顏色為深紫色，無芽孢且不運動。其中菌株HT4、HT102 菌體為小球狀，成對或呈短鏈排列；菌株HT160、HT197 菌體為中長桿狀，單在、成對或呈短鏈狀分布。

參照華鶴良[22]的方法，利用生理生化試驗對4 株乳酸菌菌株的屬進行初步鑒定。菌株HT4、HT102 和菌株HT160、HT197 的生理生化結(jié)果詳見表2 和表3。

由表2 可知，菌株 HT4、HT102 在酶觸、硝酸鹽還原、葡萄糖產(chǎn)氣、6.5%NaCl 生長、10 ℃和45 ℃生長試驗等項目均呈陰性，參照《乳酸細菌，基礎(chǔ)、技術(shù)和應用》[26]，結(jié)合形態(tài)學結(jié)果及生理生化試驗結(jié)果，將菌株HT4、HT102 初步鑒定為乳酸乳球菌屬（Lactococcus）。由表3 可知，菌株 HT160、HT197 的酶觸、硝酸鹽還原、明膠液化、H2S 產(chǎn)生以及吲哚試驗等項目均呈陰性，參照《乳酸細菌，基礎(chǔ)、技術(shù)和應用》[26]，結(jié)合菌株HT160、HT197 的形態(tài)學結(jié)果及生理生化試驗結(jié)果，將菌株HT160、HT197 初步鑒定為乳酸乳桿菌屬（Lactobacillus）。

表2 醬油渣中球狀菌株生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Phenotypic characteristics of spherical strains in soy sauce residue

表3 醬油渣中球狀菌株生理生化鑒定結(jié)果Table 3 Phenotypic characteristics of bacular strains in soy sauce residue

2.2 菌株的分子生物學鑒定結(jié)果

將4 株乳酸菌活化三代后，低溫條件下送往北京六合華大基因科技有限公司進行基因組提取，16S rRNA 基因的聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR），并對擴增的產(chǎn)物進行瓊脂凝膠電泳（電泳條件：3 μL 樣品+1%瓊脂糖凝膠，使用Trans 2K@Plus DNA Marker。），凝膠電泳圖詳見圖2。

圖2 四株乳酸菌16S rRNA PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of 16S rRNA amplified products of 4 lactic acid bacteria

由圖2 得知，4 株乳酸菌16S rRNA 基因的 PCR擴增產(chǎn)物大小均在1 500 bp 左右，且電泳帶光亮明顯，證明PCR 產(chǎn)物無雜質(zhì)可進行測序[27-28]。

得到菌株的16S rRNA 序列后，在NCBI 中Blast程序上進行比對，比對結(jié)果詳見表4。

表4 醬油渣中分離菌株的16S rRNA 序列同源性比對結(jié)果Table 4 Results of 16S rRNAsequence homology analysis of isolates from soy sauce residue

匯總模式菌株及4 株乳酸菌16S rRNA 序列，使用Mega5.0 進行發(fā)育樹的構(gòu)建，得到乳球菌發(fā)育樹見圖3 以及乳桿菌發(fā)育樹見圖4。

圖3 乳酸球菌16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence of Lactococcus

圖4 乳酸桿菌16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence of Lactobacillus

由圖3 可知，HT4、HT102 與 Lactococcuslactis subsp.lactisJCM 5805T（Genbank 登錄號：BALX01000047）同一分支，且同源性均達99%以上，將HT4、HT102 鑒定為乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）；結(jié)合表4 中NCBI比對的結(jié)果，將菌株HT4 鑒定為乳酸乳球菌霍氏亞種（Lactococcuslactis subsp.hordniae），將菌株 HT102 鑒定為乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcus lactis subsp.lactis）。

由圖 4 可知，HT160、HT197 與 Lactobacillus paracasei subsp.paracaseiATCC 25302T（Genbank 登錄號：ACGY01000162）處于同一分支，同源性均在99%以上，將其鑒定為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）。結(jié)合表4 中 HT160、HT197 的 NCBI 比對結(jié)果，將菌株HT160 鑒定為副干酪乳桿菌堅韌亞種（Lactobacillus paracasei subsp.tolerans），將菌株HT197 鑒定為副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei）。

胡傳旺[14]研究醬油發(fā)酵過程的微生物的變化規(guī)律，研究發(fā)現(xiàn)醬油發(fā)酵過程的微生物有Lactobacillus（乳桿菌）、Weissella（魏斯氏菌）、Pediococcus（片球菌）、Staphylococcus（葡萄球菌）、Bacillus（芽孢桿菌）五大類。Ansah[29]對醬油微生物進行研究，還發(fā)現(xiàn)與醬油發(fā)酵相關(guān)的乳酸菌除嗜鹽四聯(lián)球菌[30-31]，還有乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）及嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）等。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相符。

2.3 乳酸菌的生長曲線測定

4 株乳酸菌在37 ℃條件下的生長曲線如圖5所示。

圖5 乳酸菌的生長曲線Fig.5 Growth curves of 4 isolated strains

由圖5 可知，4 株乳酸菌在37 ℃的生長情況基本相似，隨著培養(yǎng)時間的延長，4 株乳酸菌的OD600nm在接種 0～3 h，OD600nm增長緩慢；在 3 h～12 h，OD600nm呈指數(shù)增加；12 h 時，OD600nm均達1.300 左右，菌株生長進入穩(wěn)定期；菌株 HT102、HT160 在接種 28 h 后 OD600nm達到最大值，分別為 1.600、1.556；菌株 HT4、HT197 在培養(yǎng) 32 h 后的 OD600nm達到最大值，分別為 1.556、1.576。4 株乳酸菌的生長強度由強到弱排序為：HT102（乳酸乳球菌乳亞種）＞HT197（副干酪乳桿菌副干酪亞種）＞HT160（副干酪乳桿菌堅韌亞種）＞HT4（乳酸乳球菌霍氏亞種）。

3 結(jié)論

本研究從醬油渣中分離得到4 株乳酸菌，分別命名為 HT4、HT102、HT160、HT197。利用形態(tài)學、生理生化特征試驗及分子生物學手段對其進行鑒定，結(jié)合NCBI 比對結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，4 株乳酸菌分屬于兩個屬、兩個種及四個亞種，將菌株HT4 確定為乳酸乳球菌霍氏亞種（Lactococcuslactis subsp.hordniae），菌株HT102 確定為乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcus lactis subsp.lactis），菌株HT160 確定為副干酪乳桿菌堅韌亞種（Lactobacillus paracasei subsp.tolerans），菌株HT197 確定為副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei）。本研究還測定了 HT4、HT102、HT160、HT197 的生長曲線，37 ℃下恒溫培養(yǎng)，4 株乳酸菌在接種30 h 左右OD600nm達到最大值，分別為 1.524、1.600、1.556、1.576，在 37 ℃條件下培養(yǎng)，4 株乳酸菌菌株的生長強度由大到小依次為HT102、HT197、HT160、HT4。本研究通過分離、純化醬油渣中的乳酸菌，為進一步研究乳酸菌的益生特性奠定基礎(chǔ)，為醬油渣的發(fā)酵品質(zhì)、綜合利用提供菌種資源和參考依據(jù)。