高鵬 肖中平 付堃 封韜 楊丹 韓梅

作者單位：130021 長春 吉林省人民醫(yī)院血液科

多發(fā)性骨髓瘤是一種以貧血、感染、骨痛、腎功能障礙等非特異性臨床表現(xiàn)為癥狀的常見血液系統(tǒng)惡性腫瘤［1］。多發(fā)性骨髓瘤前期癥狀不典型，且對常規(guī)治療方案反應(yīng)差，生存期短。母系表達(dá)基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）是存在于人類染色體14q32.3上的長鏈非編碼RNA（longnon-coding RNA，lncRNA），可抑制腫瘤發(fā)生，在人體正常組織中高表達(dá)，而在腫瘤組織中低表達(dá)或表達(dá)缺失［2-4］。生長特異抑制物5（growth arrest-specific transcript 5，GAS5）是位于人類染色體1q25.1上的lncRNA，其在生長受抑制的細(xì)胞中低表達(dá)，而在成熟組織中高表達(dá)，可能作為抑癌基因發(fā)揮作用［5-6］。但目前兩者與多發(fā)性骨髓瘤的關(guān)系鮮見報道。本研究檢測lncRNA MEG3和lncRNA GAS5在多發(fā)性骨髓瘤患者血清中的表達(dá)，并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系，探討其在預(yù)后評估中的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年1月至2016年1月吉林省人民醫(yī)院收治的87例多發(fā)性骨髓瘤患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南（2013年修訂）》診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；⑵預(yù)計生存期＞3 個月；⑶未行抗多發(fā)性骨髓瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并其他惡性腫瘤者；⑵合并自身免疫系統(tǒng)疾病者；⑶合并感染性疾病、重要器官性質(zhì)病變者。87例患者中男性46例，女性41例，年齡 30～68 歲，平均年齡（49.5±6.7）歲；按Durie-Salmon分期（D-S分期）：Ⅰ期25例，Ⅱ期28例，Ⅲ期34例。同時選取于本院進(jìn)行健康體檢的54名志愿者為對照組，其中男性27例，女27性例，年齡28～69 歲，平均年齡（48.7±5.8）歲。兩組研究對象年齡、性別等差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.725，P=0.470；χ2=0.110，P=0.740）。本研究經(jīng)吉林省人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

cDNA合成試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自BIOMIGA公司，Light Cycler96熒光定量PCR儀購自瑞士羅氏公司。

1.3 qRT-PCR檢測lncRNA MEG3和lncRNA GAS5 mRNA的表達(dá)

抽取兩組患者清晨空腹外周血液，提取血清后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆貌⑻崛⊙蹇俁NA，取5 μL總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測其完整性。按照BIOMIGA公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。以18s為內(nèi)參，引物序列見表1。取cDNA進(jìn)行qRT-PCR。定量PCR條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃ 15 s，60℃1 min，共40個循環(huán)，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。qRTPCR 反應(yīng)體系：cDNA 產(chǎn)物 2 μL，50×ROX reference dye 0.4 μL，SYBR qPCR Mix 10 μL，上下游引物各 0.8 μL，加去RNase水補(bǔ)足至20 μL。讀取目的lncRNA及內(nèi)參的循環(huán)閾值（Ct值），以2-△△Ct表示樣品中目的基因的相對表達(dá)量。

表1qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT-PCR

1.4 隨訪

采取門診復(fù)診、電話隨訪、電子郵件隨訪及信件隨訪等方式進(jìn)行隨訪，每月隨訪1次，自患者入院隨訪至2019年1月31日。隨訪中位時間為28個月，以患者死亡、失訪或最后隨訪時間為終點(diǎn)，統(tǒng)計存活、死亡、失訪人數(shù)。總生存期（overall survival，OS）定義為自患者入組開始至因任何原因死亡的時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料采用［n（%）］表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank法；采用Cox回歸模型分析lncRNA MEG3和lncRNA GAS5表達(dá)水平與多發(fā)性骨髓瘤患者OS的關(guān)系，計算風(fēng)險比（HR）及其對應(yīng)的95%可信區(qū)間（CI）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA MEG3和lncRNA GAS5在多發(fā)性骨髓瘤患者血清中的表達(dá)

多發(fā)性骨髓瘤患者血清中l(wèi)ncRNA MEG3和lncRNA GAS5的表達(dá)水平均低于對照組（5.92±0.87vs9.13±1.26，t=17.882，P＜0.001；4.27±0.51vs8.26±1.04，t=30.417，P＜0.001），見圖 1。

2.2 lncRNA MEG3和lncRNA GAS5的表達(dá)水平與多發(fā)性骨髓瘤患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)lncRNA MEG3平均表達(dá)水平（5.92）將患者分為MEG3低表達(dá)組（n=43）和MEG3高表達(dá)組（n=44），再根據(jù)lncRNA GAS5平均表達(dá)水平（4.27）將患者分為GAS5低表達(dá)組（n=37）和GAS5高表達(dá)組（n=50）。結(jié)果顯示，lncRNA MEG3和lncRNA GAS5表達(dá)水平與患者性別和血清鈣含量無關(guān)（P＞0.05），與年齡、D-S分期、惡性漿細(xì)胞數(shù)量、β2-MG水平、血紅蛋白含量有關(guān)（P＜0.05），見表 2。

圖1lncRNA MEG3、lncRNA GAS5在多發(fā)性骨髓瘤患者和健康志愿者血清中的表達(dá)Fig.1 Expression of lncRNA MEG3 and lncRNA GAS5 in serum of patients with multiple myeloma and healthy subjects

表2 lncRNA MEG3和lncRNA GAS5表達(dá)水平與多發(fā)性骨髓瘤患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Tab.2 The relationships between levels of serum lncRNA MEG3 and lncRNA GAS5 and clinical data of patients with multiple myeloma［n（%）］

2.3 lncRNA MEG3和lncRNA GAS5表達(dá)水平與多發(fā)性骨髓瘤患者生存的關(guān)系

本組所有患者均完成隨訪，無失訪病例，死亡48例，總生存率為47.83%。其中MEG3低表達(dá)組中位OS為 18 個月（95%CI：13.48～25.37），3 年總生存率為32.56%；MEG3高表達(dá)組中位OS為29個月（95%CI：21.38～34.27），3年總生存率為56.82%；兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.617，P=0.018），見圖2A。GAS5低表達(dá)組中位 OS 為 17 個月（95%CI：12.91～26.14），3年總生存率為32.43%；GAS5高表達(dá)組中位OS為30個月（95%CI：22.61～35.51），3年總生存率為 52.00%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.389，P=0.020），見圖2B。

2.4 lncRNA MEG3和lncRNA GAS5表達(dá)水平與多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的關(guān)系

單因素Cox回歸分析顯示，年齡、D-S分期、惡性漿細(xì)胞數(shù)量、β2-MG水平、血紅蛋白含量、lncRNA MEG3表達(dá)水平和lncRNA GAS5表達(dá)水平與多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后有關(guān)。多因素Cox回歸分析顯示，lncRNA MEG3低表達(dá)、lncRNA GAS5低表達(dá)和惡性漿細(xì)胞數(shù)量＞30%與多發(fā)性骨髓瘤患者不良預(yù)后有關(guān)（HR=3.503，95%CI：1.517～8.091；HR=3.319，95%CI：1.438～7.661；HR=3.333，95%CI：1.651～6.729），見表 3。

圖2lncRNA MEG3及l(fā)ncRNA GAS5表達(dá)水平與多發(fā)性骨髓瘤患者生存的關(guān)系Fig.2 Relationship between expression levels of lncRNA MEG3 and lncRNA GAS5 and survival of patients with multiple myeloma

表3 影響多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的單因素及多因素分析Tab.3 Univariate and multivariate analysis of prognosis in patients with multiple myeloma

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤源于免疫系統(tǒng)淋巴細(xì)胞，是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，預(yù)后較差［8-9］。目前臨床上評估多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后的指標(biāo)預(yù)測效果不佳，因此尋找新的預(yù)后判斷指標(biāo)具有重要意義。lncRNA是一類與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)的RNA總稱，是腫瘤診斷及預(yù)后評估的潛在分子標(biāo)志物。每種lncRNA都具有一定的結(jié)構(gòu)和生化特性，根據(jù)其自身特性，可分為促腫瘤lncRNA和抑腫瘤lncRNA［10-11］。目前認(rèn)為lncRNA在血清中表達(dá)穩(wěn)定，且重復(fù)性高，有望成為新型腫瘤診斷標(biāo)志物［12］。

MEG3是第一個被發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤抑制作用的lncRNA，由10個外顯子構(gòu)成［13］。研究顯示，lncRNA MEG3在人體正常組織中恒定表達(dá)，而在腫瘤患者組織中表達(dá)下降甚至缺失［14］。MEG3可通過多種途徑發(fā)揮抑癌作用，如在胰腺癌中通過活化p53介導(dǎo)的lncRNA MEG3可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，在肺癌中Rb信號通路基因甲基化可降低lncRNA MEG3表達(dá)水平，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖［15-16］。此外，有研究表明，lncRNA MEG3可能通過Notch、DNA甲基化等多種信號通路參與腫瘤發(fā)生發(fā)展［17-18］。GAS5包含多個外顯子和內(nèi)含子，外顯子序列轉(zhuǎn)錄出lncRNA，內(nèi)含子則編碼多個 ncRNA。PICKARD 等［19］研究表明，lncRNA GAS5可影響糖皮質(zhì)激素及其受體，從而負(fù)調(diào)控淋巴細(xì)胞存活，抑制下游基因表達(dá)，在乳腺癌患者體內(nèi)呈低表達(dá)。LIU等［20］報道lncRNA GAS5在膀胱癌組織中的表達(dá)水平低于正常組織。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS5在淋巴瘤中過表達(dá)，且可增強(qiáng)抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒效應(yīng)從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖［21］。本研究發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤患者血清中l(wèi)ncRNA MEG3和lncRNA GAS5的表達(dá)水平均低于健康對照者，提示兩者可能參與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步分析顯示，lncRNA MEG3、lncRNA GAS5的表達(dá)水平與患者年齡、D-S分期、惡性漿細(xì)胞數(shù)量、β2-MG水平和血紅蛋白含量有關(guān)，亦證明兩者均可能參與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展。生存分析結(jié)果顯示，MEG3低表達(dá)組3年的生存率低于MEG3高表達(dá)組，GAS5低表達(dá)組3年的生存率亦低于GAS5高表達(dá)組，提示lncRNA MEG3、lncRNA GAS5低表達(dá)可能與多發(fā)性骨髓瘤患者不良預(yù)后有關(guān)。Cox回歸分析顯示，lncRNA MEG3低表達(dá)、lncRNA GAS5低表達(dá)和惡性漿細(xì)胞數(shù)量＞30%是影響多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，lncRNA MEG3和lncRNA GAS5有望成為預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述，lncRNA MEG3和lncRNA GAS5在多發(fā)性骨髓瘤患者血清中低表達(dá)，且與患者年齡、D-S分期、惡性漿細(xì)胞數(shù)量、β2-MG水平和血紅蛋白含量有關(guān)，是影響患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險因素，因此檢測lncRNA MEG3和lncRNA GAS5水平有望預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤的預(yù)后。但本研究樣本量較少、隨訪時間較短，因此仍需大樣本及進(jìn)一步隨訪探究其作用機(jī)制。