白云鵬 劉洋 范曉溪

作者單位：110001 沈陽 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科

2018年，食管癌新發(fā)病例57萬余例，死亡病例超50萬例，發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中分別排第七位和第六位［1］。食管癌發(fā)病隱匿，預(yù)后較差，發(fā)現(xiàn)時已處于晚期或已發(fā)生了區(qū)域性、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移［2］。因此尋找食管癌早期診斷的生物標(biāo)志物十分必要。多項(xiàng)研究表明，microRNA-1、肌動蛋白骨架蛋白 1（LASP1）、肌動蛋白結(jié)合蛋白2（TAGLN2）和半乳糖凝集素-3結(jié)合蛋白（LGALS3BP）均與多種惡性腫瘤的增殖、侵襲和發(fā)展有關(guān)［3-6］。此外，在膀胱癌和食管癌細(xì)胞中LASP1和TAGLN2表達(dá)水平與microRNA-1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)［7-8］，在宮頸癌細(xì)胞中LGALS3BP表達(dá)水平與microRNA-1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)［9］，一項(xiàng)關(guān)于食管癌患者的臨床研究，發(fā)現(xiàn)食管癌患者血清中LGALS3BP表達(dá)水平升高［10］。因此，本研究檢測食管癌患者以及健康對照者血清中microRNA-1和LASP1、TAGLN2及LGALS3BP的表達(dá)水平，并分析其在食管癌中的診斷價值，旨在為食管癌的早期診斷提供理論參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2012年1月至2016年1月在沈陽某三甲醫(yī)院收治的128例食管癌患者作為觀察組。所有患者均經(jīng)病理確診為食管鱗狀細(xì)胞癌，在搜集血液樣本前未進(jìn)行任何方式的治療（如手術(shù)、放療和化療），排除合并其他部位腫瘤的患者。其中男性73例，女性55例；年齡（62.3±14.5）歲；腫瘤 TNM 臨床分期（2009年，第七版）：Ⅰ期33例，Ⅱ期34例，Ⅲ期29例，Ⅳ期32例。選擇同期在該院體檢的134名健康者作為對照組，其中男性69例，女性65例；年齡（63.6±12.3）歲。性別、年齡、體重、吸煙史、飲酒史及食管癌家族史等在兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審批（審批號：2012-32-2），所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

LASP1、TAGLN2和LGALS3BP酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒分別購自美國GenWay公司、LifeSpanBioSciences公司和Abcam公司；microRNA-1以及內(nèi)參基因U6引物、microRNA提取試劑盒、microRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）試劑盒和microRNA熒光定量PCR試劑盒購自生物工程（上海）股份有限公司；全波長酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司；7500 Real-time PCR儀購自美國ABI公司。

表1 兩組人群一般資料比較Tab.1 Comparison of general personal data between two groups

1.3 血清樣本采集

所有研究對象于清晨空腹采集靜脈血5 mL，室溫靜置15～20 min，1 500 r/min 離心 15 min，吸取上層淡黃色血清并分裝成兩管，-80℃保存，分別用于測定血清中 LASP1、TAGLN2、LGALS3BP 及 microRNA-1的表達(dá)水平。

1.4 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測血清中 LASP1、TAGLN2和LGALS3BP蛋白的表達(dá)水平

采用抗人LASP1、TAGLN2和LGALS3BP單抗分別包被酶標(biāo)板，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的LASP1、TAGLN2和LGALS3BP與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人LASP1、TAGLN2和LGALS3BP抗體形成免疫復(fù)合物連接，與板上辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素與生物素結(jié)合。加入酶底物工作液，出現(xiàn)藍(lán)色后加入終止液。最后采用BioTek Epoch全波長酶標(biāo)儀測定光密度值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中LASP1、TAGLN2和LGALS3BP的濃度。

1.5 PCR實(shí)驗(yàn)檢測血清中microRNA-1 mRNA的表達(dá)水平

取100 μL血清，應(yīng)用microRNA提取試劑盒提取血清中microRNA，參照miRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）試劑盒說明書進(jìn)行操作，總反應(yīng)體系為20 μL，包括 2 × miRNA RT Solution mix 10 μL、miRNA RT Enzyme mix 2 μL、microRNA 100 ng，補(bǔ)充 RNase-free water至20 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37℃60 min，85℃5 min，轉(zhuǎn)錄后cDNA產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

應(yīng)用microRNA熒光定量PCR試劑盒以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，在7500 Real-time PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測血清中microRNA-1的表達(dá)。microRNA-1序列：上游引物為5′-CTCGACAAACGTCTAAATGCT-3′，下游引物為 5′-CAGTGGAGCTGGAATGTAAAGAA-3′；內(nèi)參基因 U6 序列：上游引物為 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物為 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應(yīng)總體積為20 μL，其中 cDNA 模板 2 μL，2×miRNA qPCR master mix 10 μL，上下游引物分別為 0.5 μL，RNase-free water 7 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s；變性95℃5 s；退火/延伸60℃ 30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后采用2-△△Ct法計算microRNA-1的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件建立數(shù)據(jù)庫，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）來表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析分別檢測LASP1、TAGLN2、LGALS3BP與microRNA-1相關(guān)性。采用ROC曲線分析microRNA-1、LASP1、TAGLN2及LGALS3B對食管癌的診斷價值，采用Logistic回歸結(jié)合ROC曲線分析上述4個指標(biāo)的聯(lián)合診斷價值，通過ROC曲線下面積（AUC）評價不同指標(biāo)的診斷效能。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP及microRNA-1表達(dá)水平比較

食管癌患者血清中LASP1、TAGLN2和LGALS3BP的蛋白表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；但microRNA-1 mRNA表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見表2。

2.2 食管癌患者血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP與microRNA-1的相關(guān)性

食管癌患者血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP與microRNA-1的表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)依次為-0.713（95%CI：-0.789～-0.616）、-0.667（95%CI：-0.753～-0.558）和-0.722（95%CI：-0.796～-0.627）。見圖1。

表2 血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP和microRNA-1表達(dá)水平比較（χ±s）Tab.2 Comparison of the Expression levels of LASP1，TAGLN2，LGALS3BP and microRNA-1 in serum（χ±s）

圖1 食管癌患者血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP與microRNA-1表達(dá)的相關(guān)性Fig.1 The correlation between LASP1，TAGLN2，LGALS3BP and microRNA-1 in serum of esophageal cancer patients

2.3 microRNA-1、LASP1、TAGLN2及 LGALS3B 表達(dá)水平對食管癌的診斷價值

microRNA-1、LASP1、TAGLN2 和 LGALS3BP 的AUC 分別為 0.940（95%CI：0.913～0.967）、0.890（95%CI：0.843～0.936）、0.841（95%CI：0.794～0.889）和 0.924（95%CI：0.893～0.956）。為了進(jìn)一步提高對食管癌診斷的準(zhǔn)確性，本研究綜合上述4個指標(biāo)對食管癌進(jìn)行聯(lián)合診斷，聯(lián)合診斷的 AUC 為 0.970（95%CI：0.954～0.987），均高于單個指標(biāo)的AUC（P＜0.05）。見表3和圖2。

表3microRNA-1、LASP1、TAGLN2、LGALS3BP表達(dá)水平單獨(dú)以及聯(lián)合診斷食管癌ROC曲線分析Tab.3 ROC curve analysis of microRNA-1，LASP1，TAGLN2，LGALS3BP expression alone and combined diagnosis of esophageal cancer

圖 2microRNA-1、LASP1、TAGLN2、LGALS3BP 單獨(dú)及聯(lián)合診斷食管癌的ROC曲線Fig.2ROC curve of microRNA-1，LASP1，TAGLN2，LGALS3BP alone and combined diagnosis of esophageal cancer

3 討論

目前食管癌的診斷主要依靠內(nèi)鏡活檢，但價格相對較高，且可能對患者造成一定的創(chuàng)傷。近年來，針對血清中腫瘤相關(guān)標(biāo)志物的檢測和研究成為食管癌早期診斷的一種新的途徑［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)觀察組血清中LASP1、TAGLN2和LGALS3BP的蛋白表達(dá)水平高于對照組，microRNA-1mRNA表達(dá)水平低于對照組，且LASP1、TAGLN2、LGALS3BP表達(dá)水平與microRNA-1表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)。提示microRNA-1、LASP1、TAGLN2、LGALS3BP表達(dá)水平可能對食管癌的診斷有一定的價值。

microRNA是由長度為20～22個堿基組成的非編碼小分子RNA，在腫瘤增殖、遷移和凋亡等均有重要的生物學(xué)作用［11］。microRNA可作為生物標(biāo)志物對多種疾病（尤其是腫瘤）具有診斷價值，目前血液中有超過100種不同的microRNA被發(fā)現(xiàn)，且可用于多種類型腫瘤診斷［11］。文獻(xiàn)報道，microRNA-1與食管癌的發(fā)展和預(yù)后相關(guān)，在食管癌中microRNA-1表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因的作用［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌患者血清中microRNA-1表達(dá)顯著下調(diào)，與上述文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致。同時ROC曲線分析顯示microRNA-1對食管癌的AUC為0.940，靈敏度和特異度分別為92.19%、84.33%，說明microRNA-1在食管癌的診斷中靈敏度較好，但是特異度稍差。

LASP1是一類肌動蛋白結(jié)合蛋白，與乳腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)［12］，且其在卵巢癌、肝癌中表達(dá)上調(diào)［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，食管癌患者血清中 LASP1水平高于對照組，應(yīng)用ROC曲線分析LASP1對食管癌的診斷價值，結(jié)果顯示AUC為0.890，靈敏度和特異度分別為81.25%、99.25%，說明LASP1對食管癌的診斷中靈敏度較差，但是有很高的特異度。

TAGLN2是鈣結(jié)合蛋白家族成員，主要參與細(xì)胞分化、黏附和遷移，TAGLN2在膀胱癌表達(dá)異常［7］。本研究中食管癌患者血清中TAGLN2水平明顯升高。ROC曲線分析顯示，AUC為0.841，靈敏度和特異度分別為88.28%、70.15%，提示TAGLN2作為食管癌診斷的標(biāo)志物具有一定的應(yīng)用價值，但其特異度并不高。

LGALS3BP是一類分子量約為90 kDa的糖蛋白，與巨噬細(xì)胞凝集素、Mac 2和富含半胱氨酸的巨噬細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域成員有關(guān)，LGALS3BP可上調(diào)腫瘤細(xì)胞中黏附分子的表達(dá)［15］，其在肺癌和前列腺癌中表達(dá)上調(diào)［16-17］。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，LGALS3BP在食管癌患者血清中表達(dá)水平顯著升高［9］，本研究亦顯示其在食管癌患者血清中表達(dá)升高。ROC曲線分析顯示，AUC為0.924，靈敏度和特異度分別為80.47%、100%，說明LGALS3BP作為食管癌診斷的血清學(xué)標(biāo)志物，其特異度很高，但是靈敏度上稍弱。

在應(yīng)用上述指標(biāo)對食管癌單獨(dú)診斷的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步分析了上述指標(biāo)聯(lián)合診斷食管癌的價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合診斷的AUC明顯高于各個指標(biāo)的單獨(dú)診斷，聯(lián)合診斷的靈敏度和特異度均達(dá)到了90%以上，說明在食管癌的診斷中，多指標(biāo)聯(lián)合的診斷價值要優(yōu)于單獨(dú)指標(biāo)診斷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)血清LASP1、TAGLN2、LGALS3BP和microRNA-1對食管癌具有一定的診斷價值，此外血清 LASP1、TAGLN2、LGALS3BP和microRNA-1聯(lián)合診斷食管癌的診斷價值要高于單獨(dú)指標(biāo)診斷，且 LASP1、TAGLN2、LGALS3BP 與microRNA-1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，但microRNA-1是否可以負(fù)向調(diào)節(jié)血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP水平仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。