陳慧 龐學豐 李玉玲 吳燕紅 黃政治 林菊 陳玲

【摘 要】目的：基于網絡藥理學方法，對四妙丸治療類風濕關節(jié)炎的作用機制進行探討和研究。

方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺以口服生物利用度和類藥性為限定條件，對四妙丸所含化學成分進行篩選并預測作用靶點;通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索類風濕關節(jié)炎發(fā)病相關的靶點，將四妙丸預測靶點與類風濕關節(jié)炎相關靶點導入VENNY 2.1軟件，得到共同靶點，即四妙丸作用類風濕關節(jié)炎的靶點;通過Cytoscape 3.7.0軟件構建成分-靶點網絡，并利用軟件中Network Analyzer插件分析網絡節(jié)點度和介數(shù)中心度;最后，通過DAVID在線分析工具對靶標進行基因本體（GO）功能富集分析和生物途徑（KEGG）通路富集分析。結果：四妙丸共收集52個有效化合物，并作用于14個類風濕關節(jié)炎相關的靶點。成分-靶點網絡圖顯示前列腺素G/H合成酶2、轉錄因子AP-1及腫瘤壞死因子是四妙丸治療RA的關鍵靶點，GO功能富集分析顯示126個生物過程、8個細胞組成、5個分子功能，KEGG通路富集分析顯示35條通路。結論：四妙丸通過一氧化氮生物合成過程的正調節(jié)、鈣調蛋白1-單加氧酶活性的正調節(jié)、發(fā)熱的正調節(jié)、炎癥反應等生物過程，并涉及細胞因子活性、生長因子活性、酶結合等分子功能發(fā)揮治療類風濕關節(jié)炎的作用，且腫瘤壞死因子信號通路的調控是四妙丸治療類風濕關節(jié)炎的關鍵機制之一。

【關鍵詞】 關節(jié)炎，類風濕;四妙丸;網絡藥理學;作用機制

On the Mechanism of Simiao Wan（四妙丸）in the Treatment of Rheumatoid Arthritis Based on Network Pharmacology

CHEN Hui，PANG Xue-feng，LI Yu-ling，WU Yan-hong，HUANG Zheng-zhi，LIN Ju，CHEN Ling

【ABSTRACT】Objective：Based on the network pharmacological method，to explore the mechanism of

Simiao Wan（四妙丸）in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods：The chemical constituents of Simiao Wan were screened and the targets were predicted by TCMSP database with oral bioavailability and pharmacokinetics as the limiting conditions.The targets related to rheumatoid arthritis were retrieved by GeneCards database，and the predicted targets of Simiao Wan and targets related to rheumatoid arthritis were put into the VENNY 2.1 software to get the common targets，namely the targets of Simiao Wan for rheumatoid arthritis.The component-target network was constructed by Cytoscape 3.7.0 software，to analyze the network node degree and the median centrality by using Network Analyzer plug-in software.Finally，functional enrichment analysis of gene ontology and KEGG pathway enrichment analysis were made by DAVID.Results：A total of 52 effective compounds were collected from Simiao Wan and acted on 14 targets related to rheumatoid arthritis.Component-target network showed that prostaglandin G/H synthase 2，transcription factor AP-1 and tumor necrosis factor were the key targets of Simiao Wan in the treatment of rheumatoid arthritis.GO functional enrichment analysis showed 126 biological processes，8 cell components and 5 molecular functions.KEGG pathway enrichment analysis showed 35 pathways.Conclusion：Simiao Wan can play a role in the treatment of rheumatoid arthritis through the positive regulation of nitric oxide biosynthesis，calmodulin-1-monooxygenase activity，positive regulation of fever，inflammatory reaction and other biological processes，involving the molecular functions of cytokine activity，growth factor activity，enzyme binding，and so on.The regulation of signal pathway is one of the key mechanisms of Simiao Wan in the treatment of rheumatoid arthritis.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid;Simiao Wan（四妙丸）;network pharmacology;mechanism of action

類風濕關節(jié)炎（rheumatoed arthritis，RA）是一種以滑膜增生、關節(jié)破壞為主要特征的自身免疫系統(tǒng)疾病，臨床上常見對稱性小關節(jié)腫痛，發(fā)病過程中常伴關節(jié)外表現(xiàn)的結締組織病變。有研究顯示，RA在全球的發(fā)病率為0.5%～1.0%，我國患病率為0.42%[1]。臨床顯示，女性RA患病率顯著高于男性。隨著病情的發(fā)展，可能會導致殘疾。西醫(yī)學治療RA主要運用非甾體抗炎藥、改善病情抗風濕藥及糖皮質激素等，這些藥物雖能緩解病情，但不良反應頗多。四妙丸是治療濕熱阻絡型RA的經典方劑，不僅能減輕濕熱阻絡型RA患者的癥狀，改善患者各項指標及關節(jié)功能，而且不良反應發(fā)生率低[2-3]。

四妙丸出自清·張秉成《成方便讀》，由蒼術、黃柏、牛膝、薏苡仁組成。生物堿是黃柏最重要的活性物質，具有抗菌、改善關節(jié)軟骨代謝免疫抑制及抑制細胞免疫反應等多方面的作用[4]。蒼術在《神農本草經》中被列為上品[5]，具有抗炎，抗腫瘤，免疫調節(jié)，改善消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和神經系統(tǒng)功能等多方面的藥理作用[6-7]。牛膝具有抗炎、鎮(zhèn)痛、調節(jié)免疫、抗腫瘤、抗骨質疏松等藥理作用[8]。薏苡仁具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血栓形成、提高機體免疫力、抗腫瘤等作用[9]?，F(xiàn)代藥理學對四妙丸中單藥的作用研究頗多，但對于四妙丸治療RA的多成分、多靶點、多通路作用機制研究尚不全面。本文基于網絡藥理學方法，從分子水平闡明四妙丸的有效化合物、有效化合物和靶點以及靶點和疾病之間的機制，進一步為四妙丸治療RA的作用機制提供方法依據(jù)和理論基礎。

1 研究方法

1.1 四妙丸所含化合物的收集與篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）收集四妙丸中蒼術、黃柏、牛膝、薏苡仁的化合物，并以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性

（DL）≥0.18[10]為限定條件對所收集到的化合物進行篩選。

1.2 四妙丸所含化合物作用靶點的預測 對1.1中化合物的作用靶點進行預測，并去重。由于部分預測靶點名稱不規(guī)范，所以將預測靶點導入STRING 10.5數(shù)據(jù)庫進行校正，選擇“homo sapiens”，獲得預測靶點及對應的標準基因名。

1.3 RA發(fā)病靶點檢索及四妙丸作用RA相關靶點的預測 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索RA發(fā)病相關的靶點，取得分≥20分的靶點。將四妙丸預測靶點與RA相關靶點導入VENNY 2.1軟件，得到共同靶點，即四妙丸作用RA的靶點。

1.4 四妙丸所含化合物作用RA相關靶點相互作用的網絡構建 將每個化合物與其作用的RA靶點相聯(lián)系，通過Cytoscape 3.7.0軟件進行四妙丸的成分-RA相關靶點相互作用網絡的構建并繪制網絡圖，并利用軟件中的Network Analyzer插件分析網絡節(jié)點度和介數(shù)中心度。

1.5 四妙丸對RA作用靶點的PPI網絡構建 為了獲得四妙丸對RA作用靶點之間的聯(lián)系，將預測的四妙丸作用RA的靶點上傳至STRING 10.5數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org），選擇研究物種為人類，設置靶點之間最低要求聯(lián)系分數(shù)為0.4，并隱藏不與其他靶點聯(lián)系的靶點，獲得靶點聯(lián)系網絡圖。將該圖進一步導入Cytoscape 3.7.0軟件進行拓撲學分析并構建PPI網絡。

1.6 四妙丸治療RA預測靶點富集分析 運用DAVID數(shù)據(jù)庫，以P < 0.05作為篩選條件獲得靶點蛋白進行基因本體（GO）功能富集分析及生物途徑（KEGG）通路富集分析。選擇生物過程（biological process）、細胞組成（cellular component）和分子功能（ molecular function）3個部分繪圖。使用GraphPad Prism 7.0將GO功能富集分析中生物過程的前20個條目、細胞組成、分子功能的條目做成可視化條形圖。利用Omicshare將得到的KEGG結果制作成高級氣泡圖。

2 結果與分析

2.1 四妙丸所含化合物的收集與篩選結果 篩選出四妙丸的活性化合物共52個，其中黃柏25個，蒼術4個，牛膝17個，薏苡仁6個。

2.2 四妙丸所含化合物作用靶點的預測結果

2.1中52個化合物共檢索出830個預測靶點，并去重。將預測靶點導入STRING 10.5數(shù)據(jù)庫進行校正，獲得494個預測靶點及對應的標準基因名。

2.3 RA相關靶點檢索及四妙丸作用RA相關靶點的預測結果 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫共檢索出3528個與RA相關的靶點，相關度最高的靶點是白細胞介素（IL）-6，得分為103.41分，相關度最低的靶點是LOC108684022（FRAXA Repeat Instability Region），得分為0.21分。得分≥20分的靶點共144個。將四妙丸52個有效化合物所對應的494個預測靶點與144個RA相關靶點導入VENNY 2.1軟件，共得到14個共同靶點，即四妙丸作用RA的靶點，見圖1。

2.4 四妙丸有效化合物作用RA相關靶點相互作用的網絡構建結果 將每個化合物與其作用的RA靶點相聯(lián)系，通過Cytoscape 3.7.0軟件做出化合物-靶點聯(lián)系圖，見圖2。利用軟件中自帶的Network Analyzer插件分析網絡節(jié)點度（degree）和介數(shù)中心度（betweenness）。數(shù)值越高，表明所對應化合物或靶點在網絡中越重要。圖2中化合物槲皮素（網絡節(jié)點度= 14，介數(shù)中心度 = 0.374 34）、漢黃芩素（網絡節(jié)點度= 6，介數(shù)中心度 = 0.064 34），靶點前列腺素G/H合成酶2（PTGS2，網絡節(jié)點度 = 27，介數(shù)中心度 = 0.821 94），轉錄因子AP-1（JUN，網絡節(jié)點度 = 4，介數(shù)中心度 = 0.013 59），腫瘤壞死因子（TNF，網絡節(jié)點度= 4，介數(shù)中心度=?0.013 59），說明它們在網絡中起關鍵作用，是四妙丸治療RA的主要有效化合物和靶點。

2.5 四妙丸對RA作用靶點的PPI網絡構建結果 根據(jù)1.5中要求，STRING 10.5數(shù)據(jù)庫獲得14個靶點之間共81條聯(lián)系的網絡圖。將圖導入Cytoscape 3.6.1軟件進行拓撲學分析得出聯(lián)系其他靶點個數(shù)排名前6位的靶點依次是血管內皮生長因子A（VEGFA，13個）、TNF（13個）、IL-6（13個）、JUN（13個）、IL-1B（12個）、PTGS2（12個）。四妙丸對RA作用靶點的PPI網絡圖見圖3。

2.6 四妙丸治療RA預測靶點富集分析結果 把生物過程中前20條目、分子功能和細胞組成的條目繪制成條形圖，見圖4。

其中生物過程分析得到126個條目，細胞組成分析得到8個條目，分子功能得到5個條目。在生物過程分析中，一氧化氮（NO）生物合成過程的正調節(jié)、鈣調蛋白1-單加氧酶活性的正調節(jié)、發(fā)熱的正調節(jié)、炎癥反應、ERK1和ERK2級聯(lián)的正調節(jié)等排位靠前;在細胞組成分析中，主要包括細胞外空間、細胞外區(qū)域、質膜外側等;在分子功能分析中，包括細胞因子活性、生長因子活性、酶結合、內肽酶活性及金屬內肽酶活性。KEGG通路富集分析顯示共35條通路，取前20條通路制作KEGG高級氣泡圖見圖5，結果顯示，四妙丸治療RA的機制中TNF信號通路被顯著性富集。其中四妙丸作用于TNF通路排名靠前的化合物為槲皮素和漢黃芩素，見表1。與TNF信號通路相關的靶點有9個，分別是VCAM-1、IL-6、TNF、CCL-2、PTGS-2、JUN、IL-1B、MMP-3、SELE，其中PTGS2（網絡節(jié)點度 = 27，介數(shù)中心度 = 0.821 94）。節(jié)點度和介數(shù)中心度數(shù)值較高，是TNF通路中的關鍵靶點。此外，JUN（網絡節(jié)點度 = 4，介數(shù)中心度 = 0.013 59）和TNF（網絡節(jié)點度= 4，介數(shù)中心度= 0.013 59）也是該通路的主要靶點，與RA發(fā)生的機制密切相關。見表2。

3 討 論

RA是一種以關節(jié)滑膜炎癥為主要病理表現(xiàn)的慢性自身免疫性疾病。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素及漢黃芩素是四妙丸至關重要的有效化合物，TNF、IL-6、VEGFA、PTGS2、JUN是四妙丸治療RA的關鍵靶點。有研究表明，100，200，400 mg·kg-1的槲皮素灌胃能明顯減輕急性痛風性關節(jié)炎大鼠的關節(jié)炎癥反應，且對肝功能無損害[11]。槲皮素也能下調基質金屬蛋白酶-13/金屬蛋白酶組織抑制劑-1的比例，促進抑制軟骨細胞外基質的降解，保護關節(jié)軟骨[12]。此外，槲皮素還有綜合抗氧化能力，能通過多種途徑對多種腫瘤均具有抗癌特性[13]。大量體內外實驗研究顯示，漢黃芩素能抑制誘導型一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶-2（COX-2）的誘導，以及選擇性地抑制COX-2來減NO和前列腺素E2（PGE2）的產生，從而發(fā)揮抗炎作用[14-15]。

在四妙丸作用RA的14個靶點中，有2組靶點之間的聯(lián)系程度較高。第1組靶點是TNF、IL-6、IL-1B，均屬于炎性細胞因子，在RA滑膜病變中起核心作用。第2組靶點是VEGF，有強大的促血管增生和增強血管通透性的功能?；ぱ荇枋荝A的基本病理改變，是在慢性滑膜炎的基礎上形成的。它的形成與VEGF及其受體介導的血管新生密切相關，并存在于RA整個病理過程中。這2組靶點能較好地闡釋四妙丸治療RA的作用機制。

在GO富集生物過程和分子功能中，NO生物合成過程的正調節(jié)、細胞因子活性具有顯著意義并排位第一。NO是一種高度反應性的細胞毒性自由基，在各種疾病中都與組織損傷有關。在體外，NO對軟骨細胞的功能有害，包括抑制膠原蛋白和蛋白聚糖的合成，加快細胞凋亡。有研究顯示，RA患者血清及關節(jié)液中NO含量增高，說明NO與RA的發(fā)病密切相關[16-17]。關節(jié)滑膜中高濃度的NO不僅使滑膜和軟骨組織損傷，并且使血管壁的通透性增加而引起滲出，滑膜腫脹、充血，使進入組織中的巨噬細胞及中性粒細胞等釋放活性細胞因子共同參與滑膜的損傷。由于RA患者關節(jié)滑膜液中存在高濃度的TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細胞因子刺激滑膜組織、滑膜細胞過度表達COX-2，

引起PGE2及NO大量合成和釋放，而四妙丸所含的有效化合物能抑制COX-2在炎癥關節(jié)的表達與合成，故能明顯緩解RA患者的臨床癥狀。

TNF信號通路是四妙丸治療RA發(fā)病機制的重要通路。TNF因子在調節(jié)免疫功能的同時，過量可造成對組織的損傷[18]，能與其他促炎性細胞因子導致骨和軟骨的破壞[19]，也能抑制各種生長因子對軟骨細胞的促有絲分裂作用。本研究發(fā)現(xiàn)，四妙丸能通過作用于TNF、IL-6、VEGFA、PTGS2、JUN等14個靶點而對RA發(fā)揮作用，且有9個靶點顯著富集到TNF信號通路，從而推知，四妙丸能通過調控TNF信號通路的表達，發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用，從而達到緩解臨床癥狀，治療RA的目的。此外，從圖2中還可以看出，同一種藥物成分往往作用于多個靶點，每個靶點至少與2個以上的化合物相聯(lián)系，例如黃柏與牛膝的藥物成分槲皮素與14個靶點均有作用，蒼術與黃柏的藥物成分漢黃芩素與6個靶點均有聯(lián)系等，這些結果體現(xiàn)了中藥復方多成分、多靶標的作用特點。

本研究通過中藥活性成分的篩選、靶點預測、網絡構建與分析，從“藥物-靶點-疾病”關聯(lián)性對四妙丸治療RA的相關作用機制進行分析，找出槲皮素及漢黃芩素是四妙丸至關重要的有效化合物，TNF、IL-6、VEGFA、PTGS2、JUN是四妙丸治療RA的關鍵靶點，TNF信號通路是四妙丸治療RA發(fā)病機制的重要通路。本研究表明，四妙丸治療RA呈現(xiàn)出的多分子、多靶點協(xié)同作用優(yōu)勢明顯，并為臨床研究提供方法依據(jù)和理論基礎，將進一步加大對其研究。

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收稿日期：2019-03-24;修回日期：2019-05-08