李志超，李丹丹，薛海鵬，徐展望△

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱骨科，山東 濟南 250355）

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH），是指腰椎間盤發(fā)生退行性改變以后，在外力作用下，纖維環(huán)部分或全部破裂，單獨或者連同髓核、軟骨終板向外突出，刺激或壓迫竇椎神經(jīng)和神經(jīng)根引起的以腰腿痛為主要癥狀的一種病變[1]。其病程長、易復(fù)發(fā)，嚴重影響患者的正常生活。在中醫(yī)學(xué)中，將腰椎間盤突出癥歸于“腰痛”“腰腿痛”“痹癥”等范疇，病因病機多為跌仆閃挫，氣血瘀滯，或腎精虛損，筋骨失養(yǎng)，或寒濕內(nèi)浸，阻遏經(jīng)脈等[2]。

臨床上杜仲和續(xù)斷配伍常用于LDH的治療，其中杜仲能夠補肝腎、強筋骨；續(xù)斷能夠補肝腎、強筋骨、續(xù)折傷?，F(xiàn)代研究表明杜仲中的有效成分具有保肝護腎、提高骨密度、抑制骨吸收、調(diào)節(jié)骨代謝、延緩衰老、抗疲勞等作用[3-4]。續(xù)斷中的有效成分具有保護骨組織、保肝降脂、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[5]。由此可見，杜仲-續(xù)斷配伍治療LDH的療效確切。然而由于中藥多成分、多靶點、相互協(xié)同作用的特點，使得中藥治療疾病的作用機制十分復(fù)雜。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用多層次網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，從整體角度分析藥物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制，這種整體性、系統(tǒng)性的特點與中藥治療的整體觀念和辨證論治的原則不謀而合。本研究選擇常用藥杜仲-續(xù)斷藥對開展網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，以期明確杜仲、續(xù)斷有效成分及作用靶點，并進一步分析該藥對治療LDH的作用機制，為LDH治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 杜仲、續(xù)斷藥對活性成分的獲取與篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺數(shù)據(jù)庫（Traditional ChineseMedicineSystemsPharmacologyDatabase and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcm-spsearch.php）中分別錄入杜仲、續(xù)斷進行檢索，按口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性DL≥0.18條件篩選出有效成分。

1.2 杜仲、續(xù)斷藥對靶點的整理 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出杜仲-續(xù)斷藥對有效成分所對應(yīng)的靶點，然后導(dǎo)入 Unitprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.unitprot.org/），進行基因的標準化處理。

1.3 LDH靶點的獲取與預(yù)測 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫以及 OMIM（http：//www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫中，以“l(fā)umbar disc herniation”為關(guān)鍵詞進行檢索，將檢索到的蛋白名稱復(fù)制到Uniprot數(shù)據(jù)庫中進行基因的標準化處理，得到疾病相關(guān)的靶點信息。

1.4 杜仲-續(xù)斷活性成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將杜仲、續(xù)斷的活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建有效成分的靶點網(wǎng)絡(luò)圖，并進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點代表化合物信息，邊代表有效成分－靶點的相互作用。

1.5 蛋白（PPI）互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析 先將杜仲、續(xù)斷的有效成分作用靶點進行去重，再與LDH靶點組建“成分-靶點”數(shù)據(jù)庫，取兩者交集，組成“成分-靶點”映射文件，即尋找成分與疾病共有的靶點，將共有靶點與化合物成分輸入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建“杜仲、續(xù)斷-LDH靶點”的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用Cytoscape3.7.2軟件中的Network Analyzer進行分析，根據(jù)節(jié)點度（degree≥9）值進行篩選，得到杜仲-續(xù)斷治療LDH的核心作用靶點。

1.6 生物通路及富集分析 將1.5篩選出的PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶標導(dǎo)入 DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫中，進行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析以及 GO（Gene Ontology）生物過程的富集分析。以P≤0.05，F(xiàn)DR≤0.05為篩選標準，篩選出符合條件的前20條GO生物過程與23條KEGG通路，并用表格的形式展示。通過通路富集結(jié)果對杜仲-續(xù)斷治療LDH的作用機制進行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲-續(xù)斷藥對有效成分的靶點篩選及預(yù)測利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，分別將杜仲、續(xù)斷輸入到數(shù)據(jù)庫，進行成分搜索，將得到的成分按照口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件進行篩選，得到有效成分共36個，其中杜仲有效成分28個，續(xù)斷有效成分8個（見表1）。

2.2 杜仲-續(xù)斷成分靶點的預(yù)測及成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 利用TCMSP網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，將杜仲-續(xù)斷藥對的36個有效成分進行檢索，獲取其有效成分相對應(yīng)的靶點，共1 785個。并將其導(dǎo)入Unitprot數(shù)據(jù)庫進行基因名標準化處理，再通過Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“杜仲-續(xù)斷有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。

表1 杜仲-續(xù)斷有效成分

圖1 杜仲-續(xù)斷有效成分靶點-網(wǎng)絡(luò)圖

網(wǎng)絡(luò)圖中共有168節(jié)點組成，“V字形”代表中藥杜仲和續(xù)斷，“藍色橢圓形”代表杜仲-續(xù)斷中有效成分共36節(jié)點，“紅色橢圓形”代表有效成分所對應(yīng)的靶點共132節(jié)點，節(jié)點與節(jié)點之間的邊表示藥物成分與靶點之間的相互作用關(guān)系，最大自由度104，最小自由度為1，平均自由度為8.84，其中度值排名前五的為β-谷甾醇、槲皮素、Cinchonan-9-al，6＇-methoxy-，（9R）-、山柰酚、（-）-Tabernemontanine，節(jié)點的自由度值分別為 104、88、56、56、52，說明這些化合物是杜仲-續(xù)斷治療腰椎間盤突出癥的主要活性成分。

2.3 LDH相關(guān)靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選的與LDH相關(guān)的靶點有366個。將這些基因?qū)ytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建“疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2）。圖中共有366節(jié)點組成，紅色圓形為疾病“腰椎間盤突出癥”，藍色矩形為疾病對應(yīng)的靶點。節(jié)點與節(jié)點之間的邊表示疾病LDH與靶點蛋白之間的對應(yīng)關(guān)系。

圖2 LDH-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 杜仲-續(xù)斷“成分-疾病”靶點PPI圖

2.4 核心靶點的篩選 通過網(wǎng)絡(luò)合并，獲得杜仲-續(xù)斷和LDH的共有靶點36個（見表2）。將這36個靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫建立杜仲-續(xù)斷“成分-疾病”靶點蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），共得到36個節(jié)點，382條邊，平均節(jié)點度為21.2；再將該結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，再通過Cytoscape3.7.2軟件對該網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，以degree值≥22為篩選標準，得到20個核心靶點，環(huán)加氧酶（PTGS2）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP3）、白介素-1B（IL-1B）、C-C 基序趨化因子（2CCL2）、促分裂原活化蛋白激酶 8（MAPK8）、雌激素受體（ESR1）、血管內(nèi)皮生長因子 A（VEGFA）、促分裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素 γ（IFNG）、基質(zhì)金屬蛋白酶 2（MMP2）、一氧化氮合酶（NOS3）、轉(zhuǎn)錄因子（JUN）、表皮細胞生長因子R（EGFR）、基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP1）、表皮細胞生長因子（EGF）、髓過氧化物酶（MPO）、促分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、白介素-6（IL-6）、腫瘤抑制基因 p53（TP53），一起構(gòu)成核心網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。

表2 杜仲-續(xù)斷-LDH共有靶點

圖4“成分-疾病”核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表3 杜仲-續(xù)斷調(diào)控治療LDH生物過程分析

2.5 GO生物過程結(jié)果分析 將2.4項得到的核心靶點錄入David數(shù)據(jù)庫并進行GO生物過程分析，得到分子功能、生物過程和細胞成分條目315個，以P≤0.05，F(xiàn)DR≤0.05為標準，篩選出符合條件的前20個GO條目（見表3）。主要包括一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、細胞外間隙（extracellular space）、基因表達的正調(diào)控（positive regulation of gene expres－sion）、細胞外區(qū)（extracellular region）、脂多糖介導(dǎo)的信號通路（lipopolysaccharide-mediated signaling pathway）、血管生成（angiogenesis）、缺氧反應(yīng)（response to hypoxia）等生物過程。

2.6 KEGG通路富集分析 將2.4項得到的核心靶點錄入David數(shù)據(jù)庫，得到KEGG通路80條，以P≤0.05，F(xiàn)DR≤0.05為標準，篩選出符合條件的23條信號通路（見表4），其中包括美洲錐蟲?。–hagas disease）、HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis）、膀胱癌（Bladder cancer）、利什曼?。↙eishmaniasis）等信號通路，其中，與LDH相關(guān)的通路可能為HIF-1信號通路、TNF信號通路。

3 討論

表4 KEGG富集分析表

中醫(yī)學(xué)中LDH多屬于“腰痛”“腰腿痛”“痹癥”等范疇?！吨嗅t(yī)病證診斷療效標準》將LDH規(guī)范為血瘀證、寒濕證、濕熱證和肝腎虧虛證四證。歷代醫(yī)家對腰痛病因病機的認識各有不同，對本病的辨證論治有不同的側(cè)重，其中以補益肝腎為基本治法的方藥使用較多。杜仲、續(xù)斷二者味甘性溫，歸肝、腎經(jīng)，皆能補肝腎、強筋骨，是臨床治療肝腎虧虛之腰椎間盤突出癥的常用藥對[6]?！队耖彼幗狻分杏涊d：“杜仲，益肝腎，養(yǎng)筋骨，祛關(guān)節(jié)濕淫，治腰膝酸痛，腿足拘攣”；侯士良《中藥八百種詳解》中記載：“杜仲，甘溫補肝腎，壯筋骨，為治腰痛必用之品”?！兜崮媳静荨分杏涊d：“續(xù)斷，補肝，強筋骨。走經(jīng)絡(luò)，止經(jīng)中疼痛”，《日華子本草》中記載：“續(xù)斷，助氣，調(diào)血脈，補五勞七傷。”杜仲-續(xù)斷藥對在歷代醫(yī)家的驗方使用中十分常見，《千金要方》丹參丸，《扶壽精方》續(xù)斷丸，《本事方》思仙續(xù)斷丸等，均重視杜仲、續(xù)斷兩藥配伍，效果顯著?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[7]，杜仲-續(xù)斷配伍在補腎強骨中存在整體調(diào)節(jié)和綜合治療的優(yōu)勢，具有良好的臨床療效。

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫分析得出，β-谷甾醇、槲皮素和山柰酚可能是杜仲-續(xù)斷藥對治療LDH的關(guān)鍵成分。β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)人體甾體激素等多種生理作用[8]。β-谷甾醇可以通過減少NO的合成，抑制巨噬細胞IL-6活性，減少IL-1、TNF等炎性因子的分泌，起到抗炎的作用[9]。有研究證實，β-谷甾醇可顯著降低細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物含量、提高谷胱甘肽水平，減輕脂質(zhì)蓄積造成的肝細胞的過氧化損傷，從而起到保護肝臟的作用[10]。槲皮素具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫抑制等廣泛的藥理作用[11]。胡慶華等[12]研究表明，槲皮素可明顯緩解高果糖飲食或氧嗪酸鉀鹽誘導(dǎo)的高尿酸血癥，并可通過下調(diào)NLRP3炎癥體各組分和TLRs信號通路中關(guān)鍵分子基因和蛋白水平，緩解腎臟炎癥反應(yīng)及減輕腎損傷，起到改善腎功能的作用。袁小亮等[13]研究表明，槲皮素可顯著降低MMP-13/TIMP-1的比例，促進抑制軟骨細胞外基質(zhì)的降解，促進對關(guān)節(jié)軟骨的保護。山奈酚具有抗炎、抗氧化、抗菌等藥理作用[14]。研究表明山柰酚可顯著降低IL-1B等因子的表達，抑制大鼠OA軟骨細胞促炎介質(zhì)的表達[15]。湯利華等[16]的實驗研究表明，在糖尿病腎病大鼠中，山奈酚能夠降低大鼠蛋白尿、血肌酐和尿素氮含量，同時降低Caspase-3、Caspase-9、NLRP3、ASC和Caspase-1及炎癥因子IL-18和IL-1B的表達水平，對腎功能和組織病理損傷具有保護作用。故杜仲-續(xù)斷藥對中的β-谷甾醇、槲皮素和山柰酚等有效成分，表現(xiàn)出抗炎、保護肝臟、改善腎功能、保護軟骨等顯著功效，很可能是治療LDH的有效成分。

杜仲-續(xù)斷治療LDH的多個有效成分對應(yīng)多個靶點，通過對“藥物-疾病”核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖分析，結(jié)果顯示 PTGS2、MMP3、TNF、IL-6、IL-1B 等 20 個核心靶點在杜仲-續(xù)斷治療LDH中發(fā)揮了重要作用。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)一致認為椎間盤退變是LDH最本質(zhì)的病理變化之一，不僅表現(xiàn)有形態(tài)學(xué)和組織學(xué)的變化，同時也伴隨生化性質(zhì)的一系列改變。其中，IL-6、IL-1B、TNF和MMP3都是重要的細胞因子，是可能導(dǎo)致椎間盤退變的原因之一[17]。MMP3是細胞外基質(zhì)降解的重要蛋白之一，能夠改變椎間盤基質(zhì)內(nèi)蛋白多糖、膠原、彈性蛋白等生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及含量，從而在椎間盤退變和突出中起作用[18-19]。IL-6可刺激炎癥細胞聚集、促進炎癥介質(zhì)合成，誘導(dǎo)MMPS的表達，破壞蛋白聚糖II型膠原的比例，使髓核脫水，加速椎間盤退變[20]。TNF內(nèi)的多種生物學(xué)活性可以促進細胞因子和炎癥介質(zhì)的生成，改變內(nèi)皮細胞的通透性，參與痛覺敏感性的形成；誘導(dǎo)MMPS活性上調(diào)，減少膠原和蛋白多糖的合成[21-22]。在一項骨關(guān)節(jié)炎的研究中發(fā)現(xiàn)，槲皮素能減少IL-1B、TNF、IL-6等細胞因子的表達，抑制軟骨細胞外基質(zhì)的降解，保護關(guān)節(jié)軟骨[23]。PTGS2可參與炎癥、凋亡和免疫反應(yīng)，細胞因子和趨化因子的級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控破骨細胞與成骨細胞的生成和分化[24-25]。由此可見，杜仲-續(xù)斷可能通過作用于以上 IL-6、IL-1B、MMP3、TNF 和 PTGS2 等靶點，參與治療LDH的消炎鎮(zhèn)痛、抑制椎間盤的退變等過程。

通過KEGG通路富集分析，HIF-1信號通路、TNF信號通路等可能是治療LDH的關(guān)鍵通路。張丹等[26]認為，HIF-1在成血管-成骨耦連反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，作為上游基因調(diào)控著體內(nèi)多種成血管、成骨基因的表達，促進血管形成的同時，協(xié)同促進骨的再生。TNF信號通路中的TNF-α不僅可以使其信號通路發(fā)生異常，還可以和其他促炎性細胞因子刺激破骨細胞分化和活化，而引起骨丟失，刺激滑膜成纖維細胞和軟骨細胞產(chǎn)生降解軟骨的蛋白酶，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)和軟骨的破壞[27]。故杜仲－續(xù)斷中的β-谷甾醇、槲皮素和山奈酚等很可能通過 IL-6、IL-1B、TNF、MMP3、PTGS2等靶點作用于HIF-1信號通路、TNF信號通路，參與各細胞因子的調(diào)控，抑制炎性因子表達，促進骨的生成，減少軟骨和關(guān)節(jié)的破壞，從而發(fā)揮治療LDH的作用。

綜上所述，杜仲-續(xù)斷在治療LDH上具有多成分、多靶點、多通路的特點，因數(shù)據(jù)有限，存在一定的局限性，從整體層面分析藥物與疾病間的作用機制，初步預(yù)測了杜仲-續(xù)斷藥對參與治療LDH的核心靶標，為治療LDH提供了一些新的思路，也為今后進一步的分子生物學(xué)驗證提供了理論基礎(chǔ)。