劉偉 馮晶 夏平 浦飛飛 王志偉 汪朋 黃覓 趙曉龍

武漢市第一醫(yī)院骨科（武漢430030）

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD）及其繼發(fā)的病理改變是引起下腰痛（low back pain，LBP）的最主要原因，是脊柱失穩(wěn)、頸椎病、腰椎管狹窄等一系列脊柱退行性疾病的病理基礎［1］。近年來，提取自天然植物的化合物已用于治療退行性疾病，療效較好且副作用較少［2-3］。黃芩素是從黃芩干根中提取的一種黃酮類化合物，在中國和其他一些國家被廣泛使用。黃芩素具有抗氧化、抗病毒、抗血栓、抗心血管疾病、體內(nèi)外抗腫瘤等作用。黃芩素因其可抑制軟骨細胞的凋亡進而延緩骨性關節(jié)炎退變的作用，在骨性關節(jié)炎防治中被廣泛研究［4］，然而，迄今為止，黃芩素能否延緩椎間盤退變，以及延緩椎間盤退變的機制鮮有報道。本研究利用壓力誘導的髓核細胞退變模型，探討黃芩素是否抑制髓核細胞的凋亡，為黃芩素抗椎間盤退變的作用機制研究提供線索，并且能為中藥研發(fā)提供新思路以及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 正常椎間盤標本的獲取選取自2018年1月至2019年1月在武漢市第一醫(yī)院行脊柱側彎矯形術的患者。手術收集了4 例來自特發(fā)性脊柱側彎患者的正常髓核標本（平均年齡15.5 歲，范圍10 ～21 歲）。取材節(jié)段為L4∕L5或者L5～S1，所有標本均在髓核離體30 min 內(nèi)獲取。術前所有患者根據(jù)Pfirrmann 分級標準進行退變程度的分級，4 例髓核標本均為Ⅱ級，為正常髓核標本。本研究經(jīng)武漢市第一醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準，所有患者或其父母均簽署知情同意書。

1.2 藥品與試劑黃芩素（純度≥98%）購自阿拉丁工業(yè)公司（美國）。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色劑及CCK8 細胞活力檢測試劑盒購自Beyotime（中國上海）。兔多克隆抗體Bax，兔多克隆抗體Bcl-2，兔單克隆抗體cleaved-caspase 3，兔單克隆抗體cytochrome C、兔單克隆抗體ERK-1∕2、兔單克隆抗體p-ERK-1∕2 及兔多克隆抗體GAPDH一抗和山羊抗兔的二抗均購自Abcam（Cambridge，UK）。細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司（上海，中國）。二甲基亞砜（DMSO）和膠原酶Ⅱ購自Sigma（St.Louis，MO，USA）。細胞培養(yǎng)基購自Gibco（Grand Island，NY，USA）。

1.3 髓核細胞分離與培養(yǎng)將新鮮髓核組織剪成小碎塊，用0.1% Ⅱ型膠原酶消化6 ～8 h，離心后收集沉淀，以含20% 胎牛血清的DMEM∕F12 培養(yǎng)，置于含5%CO2的培養(yǎng)箱中，7 d 后首次更換培養(yǎng)液，以后每周更換培養(yǎng)液2 次。在倒置相差顯微鏡下觀察原代髓核細胞形態(tài)，細胞融合90%后傳代。P= 1 代的髓核細胞用來后續(xù)體外實驗研究。

1.4 髓核細胞處理（1）不同濃度黃芩素（0、5、25、50、75、100 μmol∕L）處理正常髓核細胞，24 h 后測髓核細胞的活力，選取最佳處理濃度；（2）本實驗分為3 組：正常組（A 組），取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的正常人髓核細胞，以每孔5 × 105個接種于細胞培養(yǎng)6 孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；不用（B 組）和用50 μmol∕L 黃芩素預處理24 h后，置于1 Mpa壓力培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（C組）。24 h后進行實時熒光定量PCR、Western Blot、Tunel 等一系列檢測。

1.5 CCK8取生長狀態(tài)良好的壓力誘導的髓核細胞，胰酶消化收集細胞，用培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整5 × 104∕mL，接入96 孔板，每孔100 μL 細胞懸液，同時設空白組（在細胞孔周圍孔內(nèi)加入100 μL無菌PBS），37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；待細胞貼壁后，不同濃度黃芩素處理髓核細胞（0、5、25、50、75、100 μmol∕L），每組3 個復孔，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培養(yǎng)4 h；酶標儀測定各孔吸光值OD450。

1.6 實時熒光定量PCR（Realtime PCR）根據(jù)使用說明書，使用Trizol 試劑（Invitrogen）從髓核細胞中提取總RNA。采用分光光度法測定RNA濃度后，按照逆轉(zhuǎn)盒使用說明書，用PrimeScriptTMRT Master Mix（TakaRa，Dalian，China）逆轉(zhuǎn)錄RNA。以GAPDH 為內(nèi)參，實時PCR 定量分析各組細胞中Bax、Bcl-2、cleaved-caspase 3 和cytochrome C 的表達量。每個樣品設置3 個副孔，采用2-△△Ct法計算基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequence table

1.7 Western Blot 檢測收集各組細胞，提取蛋白，測定蛋白濃度。取20 μg 蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。利用半干法將蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用含5% 脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡硝酸纖維素膜，室溫搖床封閉2 h。加入一抗Bax（1∶5 000 稀釋），Bcl-2（1∶2 000稀釋），cleaved-caspase 3（1∶1 000 稀釋）、cytochrome C（1∶10 000 稀釋）、ERK（1∶1 000 稀釋）、p-ERK（1∶2 000 稀釋）和GAPDH（1∶500 稀釋），4 ℃過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔的二抗，室溫孵育1 h，暗室曝光，觀察結果，用BandScan 分析膠片灰度值。

1.8 Tunel收集各組髓核細胞。用4%多聚甲醛固定1 h 后，用0.1%Triton X-100 培養(yǎng)10 min，用PBS 洗滌3 次。按照使用說明書，用原位細胞凋亡檢測試劑盒（F.Hoffmann La Roche Ltd.，瑞士巴塞爾）和40，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）對細胞進行染色。吸水紙擦干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.9 統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)均使用均數(shù)±標準差的形式表示。本實驗使用GraphPad Prism 7.0 軟件進行統(tǒng)計分析，每組實驗重復3 次。采用單因素方差分析和兩兩比較分析方法。P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 黃芩素增強髓核細胞的活力筆者應用不同濃度的黃芩素處理正常髓核細胞，24 h 后CCK8 檢測髓核細胞的活力。結果表明黃芩素濃度為0 ～50 μmol∕L 時，隨著濃度的增加，髓核細胞活力逐漸增強。50 μmol∕L 時，髓核細胞活力最強，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。50 μmol∕L以后，隨著黃芩素濃度的增加，髓核細胞的活力逐漸減弱。因此，黃芩素可以增強髓核細胞的活力，并且具有濃度依賴性，其中濃度為50 μmol∕L 時黃芩素的作用最強（圖1）。

圖1 黃芩素細胞活力和濃度依賴性Fig.1 Baicalein nucleus pulpocyte viability and concentration dependent

2.2 黃芩素抑制促凋亡因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯收集正常對照組、壓力組及壓力+黃芩素組等3 組細胞的RNA 和蛋白，進行RT-PCR 和WB 檢測。結果表明，壓力刺激增加Bax、cleaved-caspase 3 、cytochrome C 等促凋亡因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。然而黃芩素處理后，促凋亡因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯明顯減弱（P ＜0.05，圖2）。

2.3 黃芩素促進Bcl-2 的轉(zhuǎn)錄和翻譯對上述3組細胞的RNA 和蛋白進行檢測。RT-PCR 結果表明，壓力刺激減少Bcl-2 的轉(zhuǎn)錄，與壓力組比較，黃芩素組的Bcl-2 轉(zhuǎn)錄明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。WB 結果表明，壓力刺激明顯減少Bcl-2 的表達，與壓力組比較，黃芩素明顯增加Bcl-2 的表達，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05，圖3）。

圖2 Bax，cleaved-caspase 3 和cytochrome C 的表達Fig.2 The expression of Bax，cleaved-caspase 3 and cytochrome C

圖3 Bcl-2 的表達Fig.3 The expression of Bcl-2

2.4 黃芩素抑制壓力誘導的髓核細胞的凋亡50 μmol∕L 的黃芩素處理髓核細胞，1 MPa 壓力刺激髓核細胞，24 h 后收集3 組細胞，采用Tunel 方法測髓核細胞的凋亡。Tunel 結果表明，壓力刺激明顯增加髓核細胞的凋亡。然而，黃芩素處理后，壓力誘導的髓核細胞凋亡明顯減少（圖4）。

圖4 髓核細胞的凋亡Fig.4 Apoptosis of nucleus pulposus cells

2.5 黃芩素抑制MEK/ERK 信號通路的激活MEK∕ERK 信號通路在椎間盤退變進程中起重要作用，筆者收集上述3 組細胞的蛋白，檢測MEK∕ERK 信號通路的活性。結果表明，壓力促進ERK的磷酸化，然而黃芩素處理后ERK 磷酸化的程度明顯減弱（圖5）。

3 討論

椎間盤退變的危險因素主要包括過度壓力、基因易感性、營養(yǎng)缺乏、糖尿病、細胞外基質(zhì)含量及種類的改變、基質(zhì)金屬蛋白酶的表達增多及促炎癥因子的過表達等［5］。在以上眾多致病因素中，過度壓力在椎間盤退變中的作用尤為突出。有證據(jù)表明椎間盤的生理壓力從0.1 ～0.9 MPa。適度壓力對椎間盤具有保護作用，然而過度的壓力刺激可加劇椎間盤退變進程［6］。髓核細胞作為椎間盤組織中的重要成員，是椎間盤組織形成和維持組織代謝和結構的重要效應細胞。前期研究表明，髓核細胞在受到壓力、缺氧等各種退變因素刺激后，自身大量炎癥介質(zhì)表達增加，并被迅速分泌到髓核組織中，通過增加髓核細胞凋亡，引起椎間盤退變［7-8］。研究結果證實控制髓核細胞中壓力誘導的髓核細胞凋亡可有效緩解椎間盤退變。因此，試圖延緩過度壓力對髓核細胞的作用在椎間盤退變的研究中具有重要意義。

圖5 MAPK∕ERK 信號通路的激活Fig.5 Stimulation of MAPK∕ERK signaling pathway

黃芩素是從植物黃芩中提取的黃酮類化合物。有研究［9］報道，黃芩素具有抗炎、抗菌、抗氧化等生物學功效。黃芩素可通過抑制細胞凋亡進而達到治療疾病的目的。近年研究表明，黃芩素處理可以增加Bcl-2 的表達及導致caspase 活化的阻斷［10］。在骨性關節(jié)炎中，LI 等［11］發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠減弱IL-1β介導的軟骨細胞炎癥反應以及抑制軟骨細胞凋亡，從而延緩關節(jié)軟骨細胞的退變。另外，脊髓損傷后，黃芩素可以通過激活自噬，進而減少細胞凋亡［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，壓力刺激能夠促進髓核細胞凋亡，黃芩素能夠逆轉(zhuǎn)過度壓力對髓核細胞凋亡的調(diào)控作用。

MAPK 信號通路在椎間盤退變中發(fā)揮重要作用。ERK 屬于MAPK 激酶家族，其轉(zhuǎn)導多種細胞外刺激進入細胞內(nèi)信號級聯(lián)，參與髓核細胞外基質(zhì)合成分解代謝及細胞凋亡進程［13］。TNF-α與受體結合后可激活MAPK∕ERK 信號通路，通過增加促凋亡蛋白Bax 及減少抑制凋亡蛋白Bcl-2 的表達，促進髓核細胞凋亡［14］。然而，抑制MAPK∕ERK 信號通路的激活，可以明顯抑制IL-1β誘導的髓核細胞外基質(zhì)退變及髓核細胞凋亡，從而延緩椎間盤退變進程［15］。本研究中，壓力刺激明顯增加ERK-1∕2 的磷酸化，黃芩素處理后ERK-1∕2 的磷酸化程度明顯減弱，所以筆者認為黃芩素通過抑制MAPK∕ERK 信號通路的激活延緩壓力誘導的髓核細胞凋亡。

本研究只是初步探討了黃芩素對MAPK 信號通路的影響，未進行靶向干預研究。后續(xù)實驗可靶向調(diào)控MAPK 信號通路，觀察黃芩素對壓力誘導髓核細胞凋亡的影響。