劉 欣 ， 周志磊 ， 毛 健 *

(1.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122）

玫瑰精油是一種從薔薇科玫瑰花瓣中提煉出的天然名貴香料，其香氣優(yōu)雅濃郁、質(zhì)地純正。天然玫瑰精油多用做高檔食品、化妝品與日化產(chǎn)品的輔料，具有廣闊的市場前景[1-3]。

玫瑰精油難溶于水，其使用時存在吸收利用率低、對胃腸有刺激等缺點[4]。此外，玫瑰精油在生產(chǎn)和儲運(yùn)過程中很多成分容易損失和氧化，給其儲藏和使用帶來諸多不便。微包埋技術(shù)是解決這些問題的有效手段之一，微包埋技術(shù)主要包括微膠囊技術(shù)[5]和微乳化技術(shù)[6]。微膠囊技術(shù)將天然玫瑰精油固體化，對天然玫瑰精油起到較好的保護(hù)和控制釋放作用，但傳統(tǒng)的微膠囊通常以固體形式存在，固體粉末的物理形態(tài)制約了其在液體食品中的應(yīng)用，并且微膠囊技術(shù)成本較高、操作繁瑣，有時需要借助一些有機(jī)溶劑，限制了其應(yīng)用[7]。

微乳是由水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑按適當(dāng)?shù)谋壤园l(fā)形成的一種透明或半透明的“低黏度”各向同性且熱力學(xué)穩(wěn)定，粒徑在10～100 nm之間的溶液體系[8]。微乳可以改善植物精油的水溶性，具有更高的穩(wěn)定性和更卓越的體內(nèi)吸收、控釋和靶向性功能[9-12]。在微乳中，可稀釋 O/W型微乳（即U型微乳）具有在不改變結(jié)構(gòu)的前提下可被水無限稀釋的特性，因而具有更高的實際應(yīng)用價值[11]。

目前尚未見有關(guān)天然玫瑰精油微乳包埋的相關(guān)報道。作者以玫瑰精油為原料，研究可無限稀釋型微乳的制備工藝，為進(jìn)一步探索玫瑰精油的應(yīng)用與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 玫瑰精油、吐溫40（化學(xué)純）、吐溫60（化學(xué)純）、吐溫 80（化學(xué)純）、司班 80（化學(xué)純）、1，2丙二醇（分析純）、甘油（分析純）、聚乙二醇PEG400（分析純）、乙醇（分析純）：購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器 Thermo Fisher Trace氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Thermo公司產(chǎn)品；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司產(chǎn)品；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀：美國布魯克海文儀器公司產(chǎn)品；Discovery DHR-2流變儀：美國TA儀器公司產(chǎn)品；XH-C渦旋混合器：金壇市白塔新寶儀器廠產(chǎn)品；3240025T10分散機(jī)：德國IKA集團(tuán)產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 玫瑰精油微乳制備工藝優(yōu)化

1）擬三相圖的繪制 通過在玫瑰精油、水混合物中滴加混合表面活性劑的方法繪制擬三元相圖，即加表面活性劑法[13]。三相圖能夠有效的了解微乳的成分配比及成乳區(qū)域?；旌媳砻婊钚詣閂（吐溫80）∶V（乙醇）=2∶1，玫瑰精油為油相，將玫瑰精油與水按照質(zhì)量比 9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，精密稱取（具體質(zhì)量數(shù)見表1），混合均勻，裝在試管里，用渦旋振蕩器，邊震蕩邊緩慢滴加混合表面活性劑，溶液由澄清變渾濁，再變澄清，最終記錄臨界點樣品各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[14]。按其臨界含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別以精油、混合表面活性劑以及水為頂點，利用Origin8.0軟件繪制三相圖，確定微乳區(qū)域，然后用AutoCAD（2004）計算各微乳區(qū)域的面積占總面積的比例和最小稀釋比[14]。

2）玫瑰精油HLB測定 為了達(dá)到較好的微乳效果，表面活性劑的HLB值與被乳化藥物的HLB值應(yīng)當(dāng)較接近[15]。用吐溫40和司班80復(fù)配成不同HLB的表面活性劑，再與乙醇以質(zhì)量比2∶1的比例混合均勻，作為混合表面活性劑，繪制擬三相圖，計算微乳面積百分比及最小可稀釋比。

3）表面活性劑對微乳體系的影響 表面活性劑分別選定為吐溫40、吐溫60、吐溫80、吐溫 40+吐溫 80（質(zhì)量比 1∶1）、吐溫 60+吐溫 80（質(zhì)量比1∶1），混合表面活性劑（m（表面活性劑）∶m（乙醇）=2∶1），繪制擬三相圖，計算各微乳面積百分比及最小可稀釋比。

4）助表面活性劑對微乳體系的影響 助表面活性劑分別選定為1，2丙二醇、甘油、聚乙二醇PEG400、乙醇，混合表面活性劑（m（吐溫 80）∶m（助表面活性劑）=2∶1），繪制擬三相圖，計算各微乳面積百分比及最小可稀釋比。

5）Km值對微乳體系的影響Km值為表面活性劑吐溫80與助表面活性劑乙醇的質(zhì)量比，Km值分別選定為 1，2，2.5，3，4，繪制擬三相圖，計算各微乳面積百分比及最小可稀釋比。

6）S/O值對微乳粒徑的影響 以Km=2精密稱取吐溫80和乙醇，混合均勻作為混合表面活性劑。以不同S/O值精密稱取混合表面活性劑和玫瑰精油，在40℃下混合均勻，得到油相混合樣品。分別取1 g樣品，滴加40℃的99 g離子水，邊滴加邊磁力攪拌，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的待測液。測定O/W型玫瑰精油微乳液粒徑。

7）水添加量對微乳粒徑的影響 以Km=2精密稱取吐溫80和乙醇，混合均勻作為混合表面活性劑，制備不同水含量的微乳，制備方法為磁力攪拌法，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，測定其粒徑大小。

8）加入順序?qū)ξ⑷轶w系的影響 用繪制擬三元相圖考察加入順序?qū)ξ⑷轶w系的影響。恒溫條件下，在一定比例的玫瑰精油/表面活性劑、玫瑰精油/水、混合物中分別滴加水、混合表面活性劑（Km=2），即加水法和加表面活性劑法[6]，繪擬三元相圖，然后用AutoCAD（2004）計算微乳區(qū)域的面積比例和最小可稀釋比。

9）制備溫度對微乳體系及粒徑的影響 采用加表面活性劑法考察溫度對微乳體系形成的影響。在30、40、50℃的恒溫條件下，繪制擬三相圖，計算各微乳面積百分比及最小可稀釋比。并在不同溫度下，制備微乳，測定粒徑，考察不同制備溫度對粒徑的影響。

10）制備方法對微乳體系及粒徑的影響 按優(yōu)選的S/O=9，混合均勻，制備好無水混合油相。分別用磁力攪拌法、渦旋振蕩法、高速分散法測定微乳粒徑。

1.2.2 玫瑰精油微乳性質(zhì)表征研究

1）激光光散射法測定玫瑰精油微乳粒徑 采用配有 He/Ne激光器（λ=633 nm）的Nano-Zs90馬爾文粒徑分析儀分析測定微乳的粒徑，散射角為90°，將準(zhǔn)備好的待測樣品裝入聚苯乙烯比色皿中（折光指數(shù) 1.33），（25±0.1）時保溫 3 min 測定，分別測定 3次平均粒徑（Dz）取平均值[6]。

2）靜態(tài)頂空氣相色譜測定微乳包封率方法優(yōu)化及測定 色譜柱為HP-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣后，柱溫以4℃/min從50℃升溫至200℃，再以8℃/min的速率升溫到230℃，并保持20 min；載氣為 He，流量為 1 mL/min，分流比為 10∶1；進(jìn)樣量為 1 μL；電離方式為電子轟擊離子源（EI），離子源溫度為230℃，電離能量為70 eV；傳輸線溫度為250℃；進(jìn)樣口溫度為240℃。

選擇參照樣品為2 μL玫瑰精油，分別取含有2 μL玫瑰精油的可稀釋微乳，置于20 mL的頂空瓶中，在50℃下平衡50 min，然后采用色譜方法檢測香茅醇的峰面積。包封率的計算公式如下：

式中：S1為微乳樣品中香茅醇峰面積，S2為參照樣品中香茅醇峰面積。

按照以上優(yōu)化方法制備玫瑰精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的O/W型玫瑰精油微乳，并采用多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀，測定未經(jīng)儲存，儲存7天到6個月的玫瑰精油微乳粒徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 玫瑰精油微乳備工藝優(yōu)化

2.1.1 玫瑰精油HLB測定 HLB是表面活性劑的重要指標(biāo)，當(dāng)表面活性劑的HLB值與玫瑰精油的HLB值較為接近時，形成微乳效果更好。以下是吐溫40和司班80復(fù)配成不同HLB的混表面活性劑，繪制的擬三相圖。圖1-2顯示，隨著表面活性劑HLB的增大，微乳區(qū)域面積比增大，最小可稀釋比變小，因此玫瑰精油的HLB≥15.5。

圖1 玫瑰精油HLB測定微乳擬三相圖Fig.1 Pseudo-ternary phase diagrams determination of rose essential oil HLB

圖2 玫瑰精油HLB測定微乳擬三相圖的相關(guān)信息Fig.2 Information of pseudo-ternary phase diagrams determination of rose essential oil HLB

2.1.2 表面活性劑對微乳體系的影響 測定玫瑰精油HLB后，考察表面活性劑對微乳體系的影響，優(yōu)選出最佳表面活性劑，并將效果較好的單一表面活性劑吐溫80與吐溫40、吐溫60進(jìn)行兩兩復(fù)配，作為復(fù)配表面活性劑，考察復(fù)配后的乳化效果。下面是用不同表面活性劑繪制的擬三相圖。

圖3和圖4顯示，不同種類表面活性劑形成的微乳區(qū)域面積比，大小順序為吐溫80＞吐溫60＞吐溫40，最小可稀釋比：吐溫80＜吐溫40＜吐溫60，因此吐溫80乳化效果最好。但將吐溫80與吐溫40、吐溫60進(jìn)行兩兩復(fù)配，復(fù)配后微乳區(qū)域的面積比單一表面活性劑的微乳面積都要小，可能是因為復(fù)配后的兩種表面活性劑相互作用，形成的化學(xué)構(gòu)象不利于表面活性劑的協(xié)同增溶作用[16]。盡管有很多文獻(xiàn)報道復(fù)配后的表面活性劑有協(xié)同作用，提高乳化效率，通過該實驗發(fā)現(xiàn)并非所有的表面活性劑復(fù)配后都具有協(xié)同作用。因此選擇吐溫80為最佳表面活性劑。

圖3 不同種類表面活性劑的玫瑰精油微乳相圖Fig.3 Rose essential oil pseudo-ternary phase diagrams of different surfactants.

圖4 不同種類表面活性劑的玫瑰精油微乳相圖的相關(guān)信息Fig.4 Information of rose essential oil pseudo-ternary phase diagrams of different surfactants

2.1.3 助表面活性劑對微乳體系的影響 為提高乳化效率，需要助表面活性劑與表面活性劑一起制備微乳體系。最常見的助表面活性劑一般為短鏈醇。助表面活性劑主要作用在表面活性劑分子之間，降低液面張力，降低粘度，提高界面流動性，增大微乳增容量[17]。以下是常用的幾種助表面活性劑：乙醇、甘油、1，2丙二醇、聚乙二醇PEG400，對微乳體系的影響。結(jié)果見圖5與表1。

圖5 不同種類助表面活性劑的玫瑰精油微乳相圖Fig.5 Rose essential oil pseudo-ternary phase diagrams of different cosurfactants

表1 不同種類助表面活性劑的玫瑰精油微乳相圖的相關(guān)信息Table1 Information of rose essential oil pseudo-ternary phase diagrams of different cosurfactants

由上述實驗可知乙醇作為助表面活性劑時，微乳區(qū)域的面積比最大，最小可稀釋比最小，微乳最穩(wěn)定。乙醇流動性較好，但1，2丙二醇、甘油、聚乙二醇PEG400，較為粘稠，流動性較差，均出現(xiàn)微乳液粘稠現(xiàn)象，濁點不易判斷，微乳液放置一段時間后，有分層現(xiàn)象，微乳穩(wěn)定性差。因此選用乙醇為最佳助表面活性劑。

2.1.4Km值對微乳體系的影響 表面活性劑與助表面活性劑的質(zhì)量比即為Km值。實驗表明，當(dāng)表面活性劑和助表面活性劑種類相同時，不同Km值將會影響微乳區(qū)域大小，以下是以不同Km值繪制的微乳擬三相圖。

由圖6與表2可以看出，隨Km值增大，微乳區(qū)域面積比增大，最小可稀釋比DR也增大，S/O也增大。并對不同Km值制備的微乳粒徑進(jìn)行測定，隨Km值增大，粒徑先減小又變大，多分散指數(shù)也先變小后變大，可能是因為隨Km值增大，較高濃度的表面活性劑，由于缺少助表面活性劑的助乳化作用，粘度較高，表面張力較大，降低乳化能力，形成微乳粒徑也較大。綜合考慮最佳Km值為2。

圖6 不同Km值玫瑰精油微乳相圖Fig.6 Rose essential oil pseudo-ternary phase diagrams of different Km

表2 不同Km值玫瑰精油微乳相圖的相關(guān)信息Table2 Information of rose essential oil pseudo-ternary phase diagrams of different Km

2.1.5S/O值對微乳粒徑的影響 由于表面活性劑可以增加體系的熵值，降低相界面張力，有助于形成微乳。在水包油型的微乳中，表面活性劑非極性端與油相結(jié)合朝內(nèi)，表面活性劑極性與水相結(jié)合端朝外，表面活性劑在油水兩相間形成界面膜，形成小球狀O/W型分子[18]。由上圖可知，隨著表面活性劑比例增大，微乳粒徑和多分散指數(shù)都呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢。當(dāng)表面活性劑含量較低時，單位質(zhì)量的表面活性劑需要包埋較多的油相，微乳粒徑便會增大[15]。當(dāng)S/O值≤5∶1時，粒徑≥220 nm，超出微乳粒徑范圍，當(dāng)S/O值為6∶1時，微乳粒徑驟然變小，表明表面活性劑含量達(dá)到臨界值，為保證微乳的穩(wěn)定性及可無限稀釋性，選擇最佳S/O值為9∶1。有研究表明油相分子的大小在微乳形成過程中有很大作用[19]，在之前GC-MS檢測中發(fā)現(xiàn)玫瑰精油中長鏈烷烴含量較多，因此包埋需要較多的表面活性劑。結(jié)果見圖7。

圖7 S/O值對微乳粒徑和PDI的影響Fig.7 Effect of S/O on microemulsion particle size and PDI

2.1.6 水添加量對微乳粒徑的影響 當(dāng)水分低于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%時，體系并不存在嚴(yán)格意義的W/O型球形液滴結(jié)構(gòu)；當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%、40%、50%時，體系粘度超出了儀器的檢測范圍，未進(jìn)行測定；當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時，體系粒徑已經(jīng)大于1000 nm，體系此時應(yīng)為雙連續(xù)結(jié)構(gòu)，隨體系中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加到70%，體系仍為雙連續(xù)結(jié)構(gòu)。當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%時，體系已經(jīng)處于完全的O/W型微乳結(jié)構(gòu)。隨著水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增加90%，體系的粒徑分布不再發(fā)生較大變化。

2.1.7 加入順序?qū)ξ⑷轶w系的影響 添加順序會影響微乳制備的難易，由圖8與表3可知加水法微乳區(qū)域面積更大，最小可稀釋比更小，微乳粒徑較小且分布均勻，因此選擇加水法作為制備微乳的最佳方法。

圖8 加入順序?qū)γ倒寰臀⑷橄鄨D的影響Fig.8 Effect of adding order on rose essential oil pseudoternary phase diagram

表3 不同加入順序繪制的玫瑰精油微乳相圖的相關(guān)信息Table3 Information of rose essential oil pseudo-ternary phase diagrams made by different adding orders

2.1.8 制備溫度對微乳體系及粒徑的影響 由圖9與表4可知，與30℃相比，40℃制備的微乳區(qū)面積更大，DR更小，微乳粒徑小且均勻。由于較高的制備溫度，會造成玫瑰精油的揮發(fā)損失，當(dāng)制備溫度較低時，需要較長的平衡時間，故優(yōu)選的玫瑰精油制備溫度為40℃。

圖9 制備溫度對玫瑰精油微乳相圖的影響Fig.9 Effect of different temperature on rose essential oil pseudo-ternary phase diagram

表4 不同制備溫度玫瑰精油微乳相圖的相關(guān)信息Table4 Information of rose essential oil pseudo-ternary phase diagrams made by different temperature

2.1.9 制備方法對微乳體系及粒徑的影響 因為微乳是自發(fā)形成的，磁力攪拌較為溫和，更有助于微乳的自發(fā)形成；而高速分散法外加作用力較強(qiáng)，有可能會影響破壞微乳的自發(fā)形成，使體系狀態(tài)沒有達(dá)到最低自由能，導(dǎo)致體系形成的液滴不穩(wěn)定，體系中的顆粒聚集，粒徑增加[15]。因此，采用溫和的磁力攪拌方法，結(jié)果見表5。

表5 制備方法對玫瑰精油微乳粒徑、PDI的影響Table5 Effect of different preparation methods on rose essential oil pseudo-ternary phase diagram

2.2 玫瑰精油微乳性質(zhì)表征研究結(jié)果

取平衡時間為50 min，當(dāng)平衡溫度低于50℃時，香茅醇峰面積隨溫度升高而增大，當(dāng)平衡溫度高于50℃時，隨著溫度升高香茅醇峰面積幾乎不再變化，達(dá)到平衡狀態(tài)，因此選擇50℃為最佳平衡溫度。取平衡溫度為50℃，當(dāng)平衡時間少于50分鐘時，香茅醇峰面積隨時間延長而增大，當(dāng)平衡時間大于50分鐘時，隨著時間延長香茅醇峰面積幾乎不再變化，達(dá)到平衡狀態(tài)，因此選擇50 min為最佳平衡時間。與于夢[5]的薄荷油包封率研究結(jié)果相似，水包油型薄荷油微乳包封率為75%～80%，玫瑰精油微乳包封率為89%，對玫瑰精油達(dá)到較好的包埋效果。微乳粒徑為10.47 nm，PDI為0.06，粒徑分布均勻，且穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)語

研究制備了玫瑰精油微乳，優(yōu)化了微乳包封率測定方法，改善了玫瑰精油的水溶性，提高了穩(wěn)定性。以吐溫80為表面活性劑，乙醇為助表面活性劑，采用滴定轉(zhuǎn)相法，工藝簡單方便，制備的可稀釋微乳澄清透亮，粒徑分布均勻，屬于O/W型并具有良好的儲存穩(wěn)定性，對玫瑰精油的應(yīng)用與開發(fā)具有指導(dǎo)意義。