來(lái)景輝, 胡青海

(1.宿州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 宿州 234101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

鴨疫里默氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎，是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella Anatipestifer，RA)引起家鴨、鵝、火雞及其他鳥(niǎo)類感染的一種高度接觸性、高致死性傳染病，感染動(dòng)物常呈急性或慢性敗血癥。自然條件下家鴨最易感染，年齡越小，發(fā)病率和死亡率越高[1-2]。臨床上常表現(xiàn)為精神沉郁、不食、離群呆立等，并伴有肝周炎、纖維素性心包炎和氣囊炎等病理變化；部分出現(xiàn)腦膜炎、干酪性輸卵管炎、結(jié)膜炎、關(guān)節(jié)炎等病理變化；死亡率可高達(dá)75%，病鴨由于生長(zhǎng)緩慢，通常會(huì)變成殘次鴨或者僵鴨。臨床上鴨疫里默氏桿菌可以形成生物被膜。細(xì)菌生物被膜(Bacteria Biofilm，BBF)是其在生長(zhǎng)的過(guò)程中為了適應(yīng)外界的環(huán)境而形成的細(xì)菌菌體聚集的生存方式，一般情況下是膜狀結(jié)構(gòu)，這一層的細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)可以黏附于物質(zhì)的表面，也可以包裹在自身胞外多糖基質(zhì)當(dāng)中[3]。對(duì)于自然界中的細(xì)菌而言生物被膜對(duì)于抗生素的耐受以及免疫逃避等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，進(jìn)而導(dǎo)致了細(xì)菌對(duì)宿主的持續(xù)感染或者慢性感染[4-5]。RA產(chǎn)生生物被膜與該病在養(yǎng)鴨場(chǎng)持續(xù)性感染有關(guān)還有待于繼續(xù)研究。本研究用結(jié)晶紫法檢測(cè)21株RA形成生物被膜的比例以及形成能力，并研究?jī)煞N常用抗生素在RA生物被膜形成過(guò)程中的作用，從而為臨床上提供防治該病的提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

結(jié)晶紫(購(gòu)于生工生物工程有限公司)；TSB培養(yǎng)基(NaCl 5.0 g，胰蛋白胨17.0 g，K2HPO42.5 g，大豆胨3.0 g，Glucose 2.5 g)，無(wú)水乙醇均購(gòu)于國(guó)藥試劑公司。E.coli DH5a購(gòu)于Invitrogen公司。RA CH3株來(lái)自上海獸醫(yī)研究所。頭孢哌酮、四環(huán)素均購(gòu)于生工生物工程有限公司。TSA培養(yǎng)基制備:在1 000 mL TSB液體培養(yǎng)基中加入瓊粉15 g，高壓滅菌，無(wú)菌倒皿后，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。試?yàn)用水經(jīng)121 ℃下滅菌15 min。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及分析方法

1.2.1 生物膜形成的檢測(cè) 結(jié)晶紫法測(cè)定生物膜形成。將實(shí)驗(yàn)室分離的21株RA和E.coli DH5a轉(zhuǎn)接種到TSB培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃搖床150 rpm震蕩培養(yǎng)16 h。

用TSB液將培養(yǎng)菌液稀釋到最佳濃度OD655約為0.1 ug/mL，并將稀釋的溶液加入96孔平板中，每孔200 μL，放置在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中24 h。靜置培養(yǎng)后棄去上清液，用200 μL 0.01 mol/L PBS輕輕洗滌每孔3次，自然干燥后向每個(gè)孔加入200 μL 0.1%結(jié)晶紫，在室溫下作用30 min后棄除結(jié)晶紫，用超純水洗滌4次并自然晾干；向每孔加入100 μL 95%無(wú)水乙醇使剩余結(jié)晶紫充分溶解，并測(cè)量其在595 nm時(shí)的吸光度，E.coli DH5a作為陰性對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)測(cè)定的RA菌株生物被膜的OD595≥0.31時(shí)，作為菌株能形成生物被膜的濃度，約為陰性對(duì)照值的2倍左右；根據(jù)生物膜形成的強(qiáng)度，將這些菌株人為分為3類:生物被膜形成能力強(qiáng)株(OD595≥1)，生物被膜形成能力弱株(0.31

1.2.2 生物膜對(duì)抗生素作用的影響測(cè)定 取CH3 24 h培養(yǎng)液，用TSB液稀釋至最佳濃度OD655為0.1 μg/mL，并將稀釋的溶液加入96孔平板中，每孔200 μL，分別加入不同濃度(0.024～1 000 μg/mL)的四環(huán)素、頭孢哌酮，放于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將生物被膜吹散后分光光度計(jì)測(cè)OD655值。

判定標(biāo)準(zhǔn)：可抑制細(xì)菌出現(xiàn)的最低藥物濃度作為最小抑菌濃度；每孔10 μL菌液中經(jīng)培養(yǎng)沒(méi)有可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度，而且在TSA培養(yǎng)基平板上經(jīng)24 h培養(yǎng)沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物濃度作為最小殺菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株生物被膜檢測(cè)

采用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)21株鴨疫里默氏桿菌菌株生物膜形成，發(fā)現(xiàn)在96孔平底聚乙烯板中培養(yǎng)檢測(cè)的21株鴨疫里默氏桿菌中，有11株鴨疫里默氏桿菌能形成生物被膜，約占比為52.38%(11/21)；在這11株能形成生物被膜的鴨疫里默氏桿菌中，有6株OD595≥1，屬于強(qiáng)形成株；有5株0.31

圖1 用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌生物被膜的形成

2.2 生物被膜對(duì)抗生素作用的影響

通過(guò)檢測(cè)MIC和MBC來(lái)比較頭孢哌酮、四環(huán)素對(duì)有無(wú)生物被膜形成狀態(tài)下的CH3的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不論是MIC還是MBC，生物膜狀態(tài)的藥物濃度都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于浮游狀態(tài)下的濃度，約為4～27倍；說(shuō)明生物被膜具有保護(hù)菌體免受抗生素?fù)p害的能力。另一方面，兩種狀態(tài)下頭孢哌酮的有效濃度遠(yuǎn)低于四環(huán)素的用藥濃度，說(shuō)明試驗(yàn)鴨疫里默氏桿菌菌株對(duì)頭孢哌酮高度敏感。臨床上注射頭孢哌酮的治療效果要好于四環(huán)素。

表1 頭孢哌酮、四環(huán)素對(duì)CH3 的懸浮狀態(tài)和生物被膜形成狀態(tài)的MIC和MBC

3 結(jié)論與討論

目前,國(guó)內(nèi)大部分養(yǎng)鴨集中地區(qū)的鴨場(chǎng)都被此病所困擾，一個(gè)鴨場(chǎng)的鴨群一旦被鴨疫里默氏桿菌感染后就很難從這個(gè)鴨場(chǎng)根除此病，從而影響?zhàn)B殖效益，所以一些養(yǎng)鴨專業(yè)戶常采取的措施是過(guò)幾年就轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)場(chǎng)地建立新的鴨場(chǎng)，大大增加了養(yǎng)鴨的成本。使用安全、有效的菌苗是預(yù)防本病的一項(xiàng)重要措施。但是，越來(lái)越多的血清型在我國(guó)出現(xiàn)，增加了防治鴨疫里氏桿菌感染的難度，所以當(dāng)務(wù)之急必須對(duì)當(dāng)?shù)豏A血清型作好監(jiān)測(cè)工作，同時(shí)還需進(jìn)一步完善免疫學(xué)的快速診斷方法，加強(qiáng)鴨疫里氏桿菌病病理學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)及其發(fā)病機(jī)理和免疫機(jī)能等方面研究，以明確臨床病理特征，為臨床診治和免疫預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。

推測(cè)生物被膜可能是環(huán)境中鴨疫里默氏桿菌重要的儲(chǔ)存庫(kù)，使鴨疫里默氏桿菌病在同一個(gè)鴨場(chǎng)可反復(fù)發(fā)生和流行，難以清除的原因。試驗(yàn)檢測(cè)的21株鴨疫里默氏桿菌中，52.38%(11/21)的菌株能形成生物被膜，與胡青海等研究的41.86%的RA能形成生物被膜的結(jié)果相似。有研究表明因?yàn)樯锉荒さ拇嬖冢谂R床上可有效保護(hù)菌體免受抗菌藥物的損害，增加臨床治療本病的難度。本試驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)形成生物被膜的CH3 比其沒(méi)有形成生物膜狀態(tài)對(duì)頭孢哌酮、四環(huán)素更加耐受，與相關(guān)報(bào)道相符。這種耐受現(xiàn)象表明RA菌株可能在一些鴨場(chǎng)形成生物被膜從而導(dǎo)致該病在鴨場(chǎng)持續(xù)性感染，在適當(dāng)?shù)臈l件下，這些存活的細(xì)菌就能引起新一輪感染。

粘附、發(fā)展和成熟是生物被膜的形成過(guò)程的3個(gè)階段[6-7]，生物膜形成過(guò)程涉及一系列基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的開(kāi)啟或關(guān)閉[8-9]。探討分析鴨疫里默氏桿菌生物被膜形成的分子機(jī)制，生物被膜的形成與病菌持續(xù)性存在相關(guān)性作為研究重點(diǎn)。因此研究參與生物被膜形成的相關(guān)基因，為抗細(xì)菌性感染特別是難治性感染提供了嶄新的途徑。在此基礎(chǔ)上，研究分析生物被膜形成相關(guān)基因在形成強(qiáng)、弱和不形成生物被膜的鴨疫里默氏桿菌菌株中的分布，以篩選鴨疫里默氏桿菌生物被膜形成過(guò)程中的關(guān)鍵基因，為研究鴨疫里默氏桿菌生物被膜形成的分子機(jī)制，以及篩選抑制鴨疫里默氏桿菌生物被膜形成的靶標(biāo)等奠定基礎(chǔ)。有研究表明[10]：鴨疫里默氏桿菌菌株均攜帶asrpdp、dhdps、ftsq和hthdp基因是與鴨疫里默氏桿菌生物被膜形成相關(guān)的保守基因，將可能是潛在的藥物靶標(biāo)，既可以抑制或破壞鴨疫里默氏桿菌生物被膜的形成，又可能抑制或殺滅所有的鴨疫里默氏桿菌，為鴨疫里默氏桿菌的防控提供新的思路。