甄彩云， 明 秋， 朱婷婷， 夏德寧， 蔣圣娟

(安徽科技學院 生命與健康科學學院，安徽 鳳陽 233100)

金針菇(Flammulinavelutipes(Fr.) Sing)屬傘菌目白蘑科金針菇屬,因其菌柄細長,似金針菜,故而得名。金針菇是百姓餐桌上常見的食材,其干品中富含蛋白質,多糖類[1],多酚類等,具有抗菌、抗腫瘤、保護肝臟[2]、降血脂、提高神經系統(tǒng)認知[3]等功效,因此,金針菇藥用價值高,市場需求量大。在金針菇的工廠優(yōu)化栽培空間里,CO2濃度對金針菇的生長發(fā)育具有十分重要的作用。

大多數的食用菌不能耐受高CO2濃度,可是對于金針菇而言,高濃度的CO2可以抑制菌蓋開傘,促進菌柄伸長,從而獲得優(yōu)質高產的金針菇。CO2是一種重要的維持大氣平衡的氣體分子[4],也是活細胞內重要的信號分子,高濃度的CO2將會引起生物體的異常生理反應,誘導基因的表達變化[5]。谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)是生物體內廣泛存在的一種酶,以磷酸吡哆醛作為輔助因子不可逆地催化谷氨酸脫羧生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)。GABA是天然存在的非蛋白質組成氨基酸,也是一種重要的生理代謝物,以信號分子的形式參與高等植物生長發(fā)育的生理過程[6],比如:植物的機械損傷,缺氧,干旱和抗寒脅迫等[7],且其代謝過程受到環(huán)境因子的嚴格調控。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)是細胞內含氮類激素的第二信使,由腺苷酸環(huán)化酶催化ATP環(huán)化而成,在動物,植物,真菌體內發(fā)揮著調控信號通路的作用[8-9]。這三物質作為信號分子在細胞的異常生理進程中發(fā)揮著十分重要的作用。另外,CO2與食用菌活性物質合成相關,引起物質含量(如蛋白質,糖類等)發(fā)生變化[10]。CO2對金針菇子實體生長發(fā)育的影響勢必通過誘導或調控子實體內眾多代謝和生理發(fā)育相關的物質含量的變化來實現。

本研究通過套袋的方法人為積累高濃度CO2,測定高濃度和正常培養(yǎng)條件下金針菇的GABA、GAD、cAMP的變化,同時測定基本代謝物如蛋白質,還原糖,多酚的含量變化。研究結果將豐富CO2調控金針菇生長發(fā)育的理論體系,并為工廠化生產實踐提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

金針菇在安徽科技學院食用菌栽培基地種植培養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑

756-MC型可見分光光度計(上海元析儀器有限公司);Multiskan GO,全波長酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific);YXQ-LS50S11立式壓力蒸汽滅菌器(上海云泰儀器儀表有限公司);TGL-16G高速臺式離心機(北京時代北利離心機有限公司);XHF-D高速分散器(寧波新芝生物科技股份有限公司)等?？捡R斯亮藍G-250,3,5-二硝基水楊酸,沒食子酸,碳酸鈉等均為分析純(國藥集團化學有限公司)。GABA、cAMP、GAD酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海心語生物科技有限公司)。

1.3 金針菇的培養(yǎng)與處理

將棉籽殼與麥麩按6∶1加水攪拌均勻,調節(jié)pH 6,裝瓶,120 ℃滅菌90 min。冷卻后,在超凈工作臺上接種,25 ℃培養(yǎng)。將長滿菌絲體的培養(yǎng)瓶按出菇整齊度分為4組,每組20瓶,其中10瓶高CO2濃度下生長(套袋組),10瓶自然生長(不套袋組),每天噴灑水保持濕度。分別間隔3 d采樣,分別標記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。

1.4 樣品制備

準確稱取金針菇樣品1 g于勻漿器中,加8 mL蒸餾水研磨成勻漿,冰上靜置60 min充分提取,6 000 rpm離心20 min,上清液即為提取液。

1.5 蛋白質含量測定

以牛血清蛋白為標準品,考馬斯亮藍法測定。各試管中分別加入不同濃度的標準蛋白或待測液,然后每支試管中加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液,充分混合后放置2 min,用分光光度計在595 nm波長下測定,繪制標準曲線并計算。

1.6 還原糖含量測定

以葡萄糖為標準品,3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定。各管分別加入不同體積標準葡萄糖溶液或待測樣本,DNS溶液,充分搖勻,在沸水浴中加熱5 min,取出冷卻至室溫,分別用蒸餾水定容至20 mL,加塞后顛倒混勻,于分光光度計在540 nm測定。標準葡萄糖結果用于繪制標準曲線,計算樣本中還原糖含量。

1.7 多酚含量測定

以沒食子酸為標準品,福林酚法測定。各試管中分別不同濃度的沒食子酸溶液或待測樣本,加入福林酚試劑1 mL,5 min后,加入1 mL的7.5%的碳酸鈉溶液并加蒸餾水定容至10 mL,搖勻,室溫黑暗條件下靜置90 min,以蒸餾水作為對照,在725 nm處測定吸光度。

增值稅的價外計稅、避免重復征稅的稅制設計是國家從宏觀管理經濟良性運行采用的措施，而對每個流轉環(huán)節(jié)的單個獨立企業(yè)，一般并不關注重復征稅的問題，企業(yè)管理者需要考慮的是稅款的繳納對資金的占用及其在與交易對手商品價格博弈中的影響，進而對企業(yè)利潤的影響。實務中企業(yè)運用的各種增值稅稅收籌劃手段,如一般納稅人與小規(guī)模納稅人主體資格的選擇、不同計稅方式的選擇、對供應方開票類型的選擇等等，其根源在于增值稅的多少直接關系到企業(yè)的利益。因此，增值稅如同企業(yè)存貨的進價、職工薪酬一樣屬于企業(yè)的一項費用。

1.8 GABA、cAMP含量和GAD活性測定

應用雙抗體夾心法測定GABA、cAMP含量和GAD活性。分別用純化的GABA、cAMP和GAD抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入待測液,樣本中含有的GABA、cAMP和GAD與辣根過氧化物酶標記的抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過徹底洗滌后加底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺顯色。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度。

1.9 數據處理與分析

數據處理使用Excel 2010,統(tǒng)計學分析采用SPSS 18.0軟件。數據用平均值±標準差表示。*代表在0.05水平差異顯著。

2 結果與分析

2.1 金針菇形態(tài)變化

通過套袋(高CO2濃度)和不套袋(正常CO2濃度)的方法,人為改變金針菇培養(yǎng)環(huán)境中CO2的濃度以考察CO2對其生長發(fā)育的影響。結果發(fā)現,套袋的金針菇(圖1A)菌柄正常伸長,但是菌蓋發(fā)育緩慢(圖1C);不套袋的金針菇菌柄伸長正常(圖1B),但是菌蓋開傘較早,發(fā)育較快(圖1D)。

2.2 蛋白質含量變化

蛋白質是組成一切細胞、組織的重要成分,與各種生命現象密切相關。通過測定,得到蛋白質的標準曲線為:y=0.003 3x-0.020 8,R2=0.991 1,說明數據可靠,可以用來計算樣品蛋白質含量。如圖2所示,高CO2濃度條件下,金針菇與自然條件下生長的金針菇相比,二者在生長過程的I期、IV期蛋白質含量相當,II期套袋的含量高,III期不套袋的含量稍高。

2.3 還原糖含量變化

還原糖是指具有還原性的糖類,含有游離醛基或酮基的單糖和含有游離醛基的二糖都具有還原性。通過測定標準曲線得到方程為:y=0.715 2x-0.022,R2=0.992 9,說明數據可靠,可以用來計算樣品還原糖含量。套袋種植的金針菇還原糖的含量在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅳ期與自然條件下的金針菇相差較小(圖3),Ⅲ期套袋的還原糖含量比自然生長的高。

圖2 不同時期蛋白質含量Fig.2 Contents of protein in different periods

圖3 不同時期還原糖含量

2.4 多酚含量變化

多酚廣泛存在于自然界,其抗氧化功能可以對氧化損傷導致許多疾病起到預防和治療的作用。本實驗測定的多酚標準曲線為:y=0.008 1x-0.002 8,R2=0.990 5,說明數據可靠,可以用來計算樣品多酚含量。高濃度CO2條件下(圖4),金針菇的多酚含量在Ⅱ期和Ⅲ期升高,Ⅰ期和Ⅳ期與自然條件下的幾乎相同。

圖4 不同時期多酚含量

2.5 GABA含量變化

圖5 不同時期GABA含量

2.6 GAD活性變化

GAD酶的活性直接決定了GABA的含量。通過ELISA方法得到標準曲線為y=58.119x-0.014 9,R2=0.99,說明數據可靠,可以用來計算樣品中GAD活力。套袋種植的金針菇在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅳ期GAD活性與自然生長條件下的金針菇GAD活性相當,III期的活性比自然條件下高(圖6)。

圖6 不同時期GAD活性

2.7 cAMP含量變化

cAMP作為第二信使,可以激活下游很多條信號通路,引起機體的生理生化反應。根據ELISA法測定的標準曲線為:y=144.83x+0.060 5,R2=0.998 6,說明數據可靠,可以用來計算樣品中cAMP含量。在金針菇生長的Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期,兩種栽培條件下cAMP含量相差不大(圖7);Ⅰ期時自然生長條件下的金針菇cAMP含量高于套袋處理組。

圖7 不同時期cAMP活性

3 結論與討論

金針菇肉質脆嫩，軟潤爽滑，味道鮮美，且富含蛋白質、糖和多酚類等營養(yǎng)物質，具有很高的食用和藥用價值。《中華本草》中曾記載，金針菇性寒，具有補肝、益腸胃、抗癌的功效?，F代醫(yī)學藥理學研究表明：金針菇能促進兒童智力發(fā)育，有“增智菇”美譽。它能防治成人高血壓、胃潰瘍和肝臟疾病，抵抗疲勞，并且還具有一定的抗癌功效。因此，金針菇是百姓餐桌上常見的藥食同源的食用菌類食品，市場需求量很高。

栽培環(huán)境中，過高或過低的CO2濃度都會影響食用菌的生長發(fā)育，當空氣中CO2濃度較高時，平菇、秀珍菇和猴頭菇會發(fā)育成珊瑚狀畸形菇；靈芝不形成菌蓋，菌柄分化成鹿角狀等。所以，適當濃度的CO2對食用菌的生長發(fā)育具有重要的調節(jié)作用。到目前為止，對于CO2調控食用菌子實體發(fā)育的機理研究主要有以下幾點：(1)某些種類的食用菌可以利用CO2作為其在基質上定位子實體的信號[11-12]?？拷耘嗷|的空氣流動慢，局部CO2濃度較高，影響孢子散布，抑制菌蓋擴展，促進菌柄伸長以尋找有利于子實體發(fā)育的低濃度CO2空間。(2)CO2與食用菌活性物質合成相關[10]。CO2激發(fā)子實體產生活性因子，調控其生長發(fā)育；CO2還引起子實體內某些物質含量發(fā)生變化。(3)CO2抑制呼吸作用，調節(jié)菌絲體內的貯藏化合物向結構化合物轉化，從而影響子實體生長發(fā)育所需營養(yǎng)物質的正常供給，進而影響子實體的正常生長發(fā)育[13]。金針菇比較特殊，其主要食用部位是菌柄，所以菌柄的生物量取決于菌柄的伸長能力。在栽培過程中，發(fā)現：CO2濃度不同時，金針菇最為顯著的特征是形態(tài)的差異，高CO2濃度促使其呈現出較長的菌柄和較小的菌蓋形態(tài)。

通過測定金針菇的蛋白質、還原糖和多酚的含量，發(fā)現：在生長發(fā)育的Ⅰ-Ⅳ期，當CO2濃度較高時，蛋白質含量在Ⅰ期不變，Ⅱ期升高；還原糖含量在Ⅰ和Ⅱ期降低，Ⅲ期升高；多酚類物質Ⅰ期不變，而在Ⅱ和Ⅲ期升高。這說明，金針菇受到高濃度CO2調控后，糖類首先被消耗，使貯藏物質變成能量物質，為子實體基本生長發(fā)育提供能量和代謝中間產物；其次，蛋白質類開始合成導致含量慢慢增加，而多酚類含量增加可能與其抗氧化功能有關。

除了貯藏物質發(fā)生變化外，活性因子也對CO2濃度升高做出反應。GABA作為一類信號分子，其含量較低，卻對高等植物發(fā)育過程(如植物的機械損傷，缺氧，干旱，耐鹽和抗寒脅迫等)發(fā)揮重要的調節(jié)作用[14-15]。在番茄果實發(fā)育成熟過程中，GABA大量積累[16]，調節(jié)碳氮營養(yǎng)平衡。GABA通過信號轉導途徑促進煙草的花粉管的生長[17]。實驗結果表明，高濃度CO2脅迫下，GABA的含量在I到III期均低于正常對照組，Ⅳ期含量與對照組相當。這說明該物質在初期被消耗，發(fā)育的后期含量上升。GAD是催化GABA合成的關鍵酶，參與植物的衰老，種子的發(fā)育與成熟及植物對外界脅迫的應激反應等過程[18]，其活性直接與GABA的含量有關。在Ⅰ和Ⅱ期，GAD活性低于對照組，Ⅲ期GAD活力上升，從而使Ⅳ期的GABA含量上升至對照組水平。這些結果說明，GAD的活性可以被高濃度CO2所抑制，原因可能是GAD催化生成GABA的同時，還生成CO2，CO2反饋抑制GAD的活性。低含量的GABA可能促進菌柄生產，抑制菌蓋開傘有關。實驗還發(fā)現，cAMP含量在兩種栽培條件下，變化不大，可能在金針菇發(fā)育過程中cAMP的作用較小。

綜上所述，在栽培過程中，高濃度CO2影響金針菇的蛋白質，糖類和多酚類的含量變化，而且最先響應的是糖類物質；GABA含量和GAD活性呈現出先抑后揚的模式，可能與菌柄伸長和菌蓋延遲開傘有關；cAMP含量變化較小，可能對菌柄伸長的貢獻較小。高濃度CO2調控GAD和GABA參與金針菇菌柄伸長的具體分子機制有待進一步研究。