陳 昕 ，李 琪 ，2，曹倩倩 ，黃春萍 *，2

（1.四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610068；2.農(nóng)田生態(tài)服務(wù)能力建設(shè)四川省高校工程中心，四川 成都610068）

植物內(nèi)生菌包括真菌、細(xì)菌和放線菌，主要存活于健康植物組織內(nèi)部，但不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物類群[1-2]。植物內(nèi)生菌可產(chǎn)生與宿主植物相同或者相似的具有生物活性的代謝產(chǎn)物，包括萜類、芳香類、多肽類等化合物[2-4]。同時，這些活性成分通常具有抗腫瘤、抑菌和殺蟲等作用，且代謝產(chǎn)物豐富，是新型藥物的潛在資源[5-6]。藥用植物內(nèi)生菌多樣性的研究對進(jìn)一步探索內(nèi)生菌與宿主植物間的生態(tài)關(guān)系、反應(yīng)宿主植物的生存環(huán)境和生長狀態(tài)、生物學(xué)資源的開發(fā)等具有重要意義。

麻花秦艽（Gentiana stramineaMaxim）為龍膽科龍膽屬多年生草本植物，在我國有2000多年的種植歷史，廣泛分布于四川西北地區(qū)、青海大部分地區(qū)和甘肅、西藏、寧夏部分地區(qū)[7]，是我國三級重點保護(hù)野生藥材之一[8-9]，具有退虛熱、止痹痛、清濕熱、祛風(fēng)濕的功效，可用于治療中風(fēng)半身不遂、風(fēng)濕痹痛、骨節(jié)酸痛、筋脈拘攣、骨蒸潮熱、濕熱黃疸、小兒疳積發(fā)熱等癥狀[7]。秦艽具有環(huán)烯醚萜類、黃酮類、生物堿和其他化學(xué)成分，以環(huán)烯醚萜為其特征成分[10-11]，這些活性成分含量在其不同組織中存在明顯的差異[12]。內(nèi)生菌復(fù)雜的群落結(jié)構(gòu)是秦艽植物環(huán)境的一個重要組成，對其生長具有明顯的影響，如：次級代謝產(chǎn)物的積累、藥材質(zhì)量、藥材道地性等等[13-14]。同時，內(nèi)生菌和植物之間密切的共生關(guān)系使內(nèi)生菌能影響植物有效成分的合成，或者內(nèi)生菌自身便合成某些有效成分[15]。

然而，目前對麻花秦艽植物資源的研究主要集中在其化學(xué)成分、資源開發(fā)和藥理藥效等方面[16-18]，對該植物內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)的研究報道非常有限。另一方面，隨著對秦艽植物需求量猛增，長期采挖和環(huán)境惡化，使野生秦艽資源遭到嚴(yán)重的破壞，最終制約了秦艽植物資源的健康發(fā)展。秦艽內(nèi)生菌多樣性及其相關(guān)研究對于探索秦艽與其內(nèi)生菌之間的互動機制、反映秦艽的生長狀態(tài)和生存環(huán)境、開發(fā)具有超常生態(tài)和醫(yī)學(xué)功能的生物資源等均具有重要意義。本研究中將通過對麻花秦艽根、莖、葉和花等不同組織部位中的可培養(yǎng)內(nèi)生菌的數(shù)量和組成等結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，探討麻花秦艽可培養(yǎng)內(nèi)生菌結(jié)構(gòu)與其主要藥效成分龍膽苦苷含量之間的關(guān)系，以期為秦艽內(nèi)生菌的資源情況及內(nèi)生菌生物活性成分研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品來源 麻花秦艽于2015年夏季采自四川理縣米亞羅（31°14′—31°19′N，102°53′—102°57′E，海拔 2458～4619 m）。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[19]（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，氯化鈉 5，瓊脂 20，pH 7.0～7.2；馬?。∕artin）培養(yǎng)基[19]（g/L）：葡萄糖 10，蛋白胨 5，磷酸二氫鉀1，瓊脂20，1/3000孟加拉紅100 mL/L，臨用前加0.03%鏈霉素稀釋液100 mL/L，自然pH。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 取麻花秦艽植株用自來水沖洗，去除表面的泥土，室溫晾干。將清洗的秦艽根、莖、葉、花用滅菌手術(shù)刀切成1 cm見方的小塊（段、片），切掉表層。然后轉(zhuǎn)到無菌操作臺上進(jìn)行消毒：無菌水漂洗2次，75%乙醇浸泡2 min，0.01%汞浸泡4 s，無菌水沖洗3次[20]，以備內(nèi)生菌分離純化用。

1.2.2 菌株的分離純化 將處理后的各組織置于滅菌研缽中，加入9 mL無菌水，研磨成勻漿菌懸液，將制備的菌懸液10倍梯度依次稀釋至1×10-1～1×10-5，分別取 100 μL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基，每個處理重復(fù)3次。細(xì)菌置于37℃培養(yǎng)，真菌置于25℃培養(yǎng)。在同樣培養(yǎng)條件下放置相應(yīng)空白培養(yǎng)基，同時吸取1.2.1中樣品處理時最后一次無菌水沖洗液各100 μL涂布牛肉膏蛋白胨和馬丁平板做相應(yīng)的對照培養(yǎng)，若培養(yǎng)后無細(xì)菌或真菌長出，證明表面消毒徹底[21-22]。培養(yǎng)2～3 d后，培養(yǎng)基中可見有菌落形成，計算菌落數(shù)。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等的大小、形狀、邊緣、光澤、質(zhì)地、顏色和透明程度等挑取單菌落轉(zhuǎn)接（劃線）入對應(yīng)的培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)[23]。

1.2.3 內(nèi)生菌的鑒定 按照文獻(xiàn)[20]方法對細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)形態(tài)鑒定。根據(jù)《真菌鑒定手冊》[24]，對真菌進(jìn)行常規(guī)形態(tài)鑒定。細(xì)菌和真菌總DNA的提取分別采用康為世紀(jì)（北京）生物科技有限公司細(xì)菌和真菌基因組DNA提取試劑盒按標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行。按照文獻(xiàn)[1，17]方法，采用27F/1429R引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因片段。按照文獻(xiàn)[25]方法，采用ITSI/ITS4擴(kuò)增真菌18S rRNA基因片段。得到的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶回收后由擎科生物有限公司進(jìn)行序列測定。測序得到的核苷酸序列在NCBI上GenBank中進(jìn)行BLAST分析，采用MEGA 4軟件對序列進(jìn)行相似性分析，并以Neighborjoining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap（1000次重復(fù)）進(jìn)行檢驗。

1.2.4 龍膽苦苷相對含量檢測 麻花秦艽主要藥用成分龍膽苦苷的檢測按照文獻(xiàn)[26]的方法采用HPLC檢測。麻花秦艽各組織部位龍膽苦苷的含量見表1。

表1 麻花秦艽根、莖、葉、花中龍膽苦苷相對含量（n=3）Table1 Gentiopicrin contents in roots，stems，leaves and flowers of Gentiana straminea Maxim（n=3）

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，多重比較采用最小顯著差異法（LSD）。微生物數(shù)量與龍膽苦苷含量的相關(guān)關(guān)系采用Pearson法。數(shù)據(jù)整理、計算與作圖均采用Microsoft Excel 2013軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 麻花秦艽不同組織部位可培養(yǎng)內(nèi)生菌數(shù)量

通過稀釋涂布法，對麻花秦艽各組織部位可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。根中的可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌和真菌的數(shù)量最高，分別為（8.77±0.71）×105cfu/g 和（2.00±1.05）×104cfu/g；莖中的可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌顯著性低于其他組織，并且從莖和花中沒有分離到可培養(yǎng)內(nèi)生真菌。內(nèi)生菌的種類和數(shù)量會受到不同分離部位的影響[26]，同時大量的研究發(fā)現(xiàn)藥用植物內(nèi)生菌與其活性成分存在一定的相關(guān)性[27-29]。麻花秦艽不同分離部位龍膽苦苷含量存在顯著性差異（表1），這可能是導(dǎo)致其各部位內(nèi)生菌數(shù)量存在顯著性差異的主要原因（表3）。

2.2 麻花秦艽可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的鑒定

從麻花秦艽的不同組織中共分離到內(nèi)生細(xì)菌10 株（QJ1～QJ10），其形態(tài)特征見表 4。

表2 麻花秦艽不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌與內(nèi)生真菌數(shù)量（±s）Table2 Quantity of the endophytic bacteria and fungi in the different parts of Gentiana straminea Maxim（±s）cfu/g

表2 麻花秦艽不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌與內(nèi)生真菌數(shù)量（±s）Table2 Quantity of the endophytic bacteria and fungi in the different parts of Gentiana straminea Maxim（±s）cfu/g

注：不同小寫字母表示內(nèi)生細(xì)菌或內(nèi)生真菌的數(shù)量在不同組織部位中差異性顯著（P＜0.05）。

組織部位真菌數(shù)量細(xì)菌數(shù)量根(2.00±1.05)×10 4a 0 b 莖(8.77±0.71)×10 5a(2.13±1.55)×10 3 b葉(1.00±0.30)×10 5c (1.00±0.90)×10 c花(3.43±1.12)×10 5c 0 b

表3 可培養(yǎng)內(nèi)生菌數(shù)量與龍膽苦苷相對含量的相關(guān)性分析Table3 Correlation analysis of quantity of the cultivable endophytes and content of gentiopicrin of Gentiana straminea Maxim

表4 麻花秦艽可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌形態(tài)與培養(yǎng)特征Table4 Morphological and cultured characteristics of culturable endophytic bacteria in Gentiana straminea Maxim

對菌株QJ1～QJ10進(jìn)行16S rDNA基因測序，測序結(jié)果在GenBank進(jìn)行同源性比對，結(jié)果見表5。菌株QJ1與伯克霍爾德菌（Burkholderiasp.，登錄號KJ004488.1）的同源性為 99%；QJ4與短小桿菌（Curtobacteriumoceanosedimentum，登 錄 號JF460771.1）的同源性為100%；QJ5與假單胞菌（Pseudomonassp.，登錄號 KM253123.1）的同源性為99%；QJ6與拉恩菌（Rahnellasp.，登錄號KT580643.1）的同源性為 99%；QJ7與假單胞菌（Pseudomonassp.，登錄號 JQ511859.1）的序列同源性為97%以上，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）后，分別位于同一系統(tǒng)發(fā)育分支上；QJ8與新鞘氨醇單胞菌（Novosphingobiumsp.，登錄號 KM252978.1）的序列同源性為 100%；QJ10與假單胞菌（Uncultured pseudomonassp.，登錄號 GU201572.1）的序列同源性為99%。另外，QJ2和杜搟菌（Duganellasp.，登錄號KF424273.1）的序列同源性最大，但只有90%；QJ3與不可培養(yǎng)細(xì)菌（Uncultured bacterium，登錄號DQ984599.1）和黃單胞菌（Xanthomonadaceae bacterium，登錄號JN872548.1）的序列同源性為最大，但均只達(dá) 93%；QJ9 與泛菌（Pantoeasp.，登錄號JN853256.1）的序列同源性最大，但只達(dá)88%。綜合同源性比對結(jié)果并結(jié)合其培養(yǎng)特征，菌QJ1、QJ4、QJ6和QJ8分別屬于伯克霍爾德菌、短小桿菌、拉恩氏菌、新鞘氨醇單胞菌，而菌株QJ5、QJ7和QJ10均屬于假單胞菌屬。此外，在本研究中菌株QJ2、QJ3和QJ9的16s rDNA序列與GenBank中已報道序列一致性低于97%，這顯示出麻花秦艽內(nèi)生細(xì)菌微生物種群可能存在新的物種資源[22]。

2.3 麻花秦艽可培養(yǎng)內(nèi)生真菌分離鑒定

從麻花秦艽的不同組織中共分離到內(nèi)生真菌3株（QJ11～QJ13），其形態(tài)特征見表6。

表5 麻花秦艽可培養(yǎng)內(nèi)生菌測序比對結(jié)果Table5 Result of blast by Genbank of culturable endophyes in Gentiana straminea Maxim

圖1 麻花秦艽內(nèi)生細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic tree of the endophytic banterium of Gentiana straminea Maxim

表6 麻花秦艽可培養(yǎng)內(nèi)生真菌形態(tài)與培養(yǎng)特征Table6 Morphological and cultured characteristics of Culturable endophytic fungus in Gentiana straminea Maxim

對菌株QJ11～QJ13進(jìn)行ITS基因測序，并在GenBank中進(jìn)行同源性比對，結(jié)果見表5，菌株QJ11與花斑曲霉（Aspergillus versicolor，登錄號LC105686.1）的同源性達(dá)99%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），二者位于同一系統(tǒng)發(fā)育分支上。綜合同源性比對結(jié)果和QJ11與花斑曲霉在發(fā)育樹系統(tǒng)中的位置，并結(jié)合形態(tài)特征，菌株QJ11應(yīng)屬于花斑曲霉。菌株QJ12與梅花狀青霉（Penicillium herquei，登錄號JN246042.1）的序列同源性達(dá)97%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）后，二者位于同一系統(tǒng)發(fā)育分支上。菌株QJ13與不可培養(yǎng)真菌（uncultured fungus，登錄號KM233157.1）的同源性最大，達(dá)98%，同時與花斑曲霉（Aspergillus versicolor，登錄號 LC105684.1）的序列同源性也達(dá)97%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）后，三者位于同一系統(tǒng)發(fā)育分支上。

圖2 麻花秦艽內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic tree of the endophytic fungus of Gentiana straminea Maxim

2.4 麻花秦艽可培養(yǎng)內(nèi)生菌在各組織部位中的分布

從麻花秦艽中共分離純化得到10株細(xì)菌和3株真菌。初步鑒定，內(nèi)生真菌有2個屬、細(xì)菌有8個屬，它們在各組織部位的分布見表7。麻花秦艽根、莖、葉和花中含有不同種類和數(shù)量的內(nèi)生菌。麻花秦艽莖中內(nèi)生菌分離得到7屬，葉部分離得到7屬，根部分離得到8屬，花部分離得到3屬。其中，根中的內(nèi)生菌種類最多，而花中的內(nèi)生菌種類最少。菌株QJ2在不同組織部位中均有發(fā)現(xiàn)且數(shù)量最多，為麻花秦艽內(nèi)生菌中的優(yōu)勢屬，其包括的數(shù)量所占比例為59.9%。菌株QJ11是真菌中占內(nèi)生菌總數(shù)量比例最高的屬，其包括的數(shù)量所占比例為86.7%。其余菌株QJ7和QJ9僅在莖中分離得到，菌株QJ10僅在根中分離得到，菌株QJ12僅在葉中分離得到，菌株QJ11和QJ13僅在根中分離得到。

對不同組織部位分離出的內(nèi)生菌數(shù)量進(jìn)行分析可知，在麻花秦艽根中以菌株QJ2和QJ5為優(yōu)勢屬，其所包括數(shù)量分別占該組織部位內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)的81.3%和6.2%，在麻花秦艽莖中以QJ2和QJ3為優(yōu)勢屬，占該組織部位內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)的46.0%和36.3%，在麻花秦艽葉中以QJ2和QJ3為優(yōu)勢屬，占該組織部位內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)的42.9%和22.0%，在麻花秦艽花中以QJ2和QJ3為優(yōu)勢屬，占該組織部位內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)的41.9%和36.3%。

表7 麻花秦艽可培養(yǎng)內(nèi)生菌在各組織部位中的分布(±s)Table7 Distribution of endophytes in Gentiana straminea Maxim at the different parts(±s) cfu/g

表7 麻花秦艽可培養(yǎng)內(nèi)生菌在各組織部位中的分布(±s)Table7 Distribution of endophytes in Gentiana straminea Maxim at the different parts(±s) cfu/g

菌株葉莖根Q J 1(1.33±0.58)×10 4 00(6.33±4.16)×10 3(3.41±2.01)×10 5 Q J 2(8.90±0.85)×10 4(1.18±0.75)×10 3 Q J 3(1.67±0.58)×10 4(4.57±2.21)×10 4(9.30±1.13)×10 2(1.53±0.28)×10 4 Q J 4(1.77±0.35)×10 4(1.30±0.61)×10 4(1.40±0.61)×10 4(2.83±1.46)×10 2(2.60±0.62)×10 4 Q J 50(3.67±1.15)×10 4 0(0.71±0.23)×10 2 Q J 6(9.67±1.17)×10 3(8.67±1.53)×10 3 0 Q J 70 0(0.20±0.10)×10 2 0 Q J 8(0.19±0.04)×10 2 0(4.43±2.50)×10 3(0.92±0.45)×10 4 Q J 9(0.62±0.15)×10 2 00 Q J 10(1.90±0.66)×10 3 00 0(8.00±3.46)×10 3 Q J 11 00 0 Q J 12 00 00(0.10±0.09)×10 2(1.20±0.79)×10 3 Q I 13 00 0花0

3 結(jié)語

近年來關(guān)于秦艽內(nèi)生菌的報道較少，并且主要集中在從秦艽組織中分離純化一些代謝產(chǎn)龍膽苦苷的微生物菌株。比如：趙強[13]從秦艽的根中分離得到1株產(chǎn)龍膽苦苷的內(nèi)生真菌根霉QJ18，對QJ18的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出較優(yōu)的碳源、氮源、溫度和pH條件。徐婉如[30]對產(chǎn)龍膽苦苷的秦艽內(nèi)生真菌進(jìn)行誘變育種，篩選得到的突變株QJ18-UV-23和QJ18-H-25的龍膽苦苷產(chǎn)量分別是未突變菌株的1.362倍和1.148倍。此外，曾憲軍等[15]從麻花秦艽中分離得到了1株產(chǎn)龍膽苦苷的內(nèi)生真菌腐皮鐮刀菌Gj-01，通過發(fā)酵培養(yǎng)后積累龍膽苦苷的量為4.13 mg/L。另一方面，內(nèi)生菌的分布規(guī)律可能與宿主本身的特性及內(nèi)生菌的種類相關(guān)，因此在宿主的不同器官中具有不同的分布和結(jié)構(gòu)[31]。在其他藥用植物中的研究表明不同組織部位中內(nèi)生菌多樣性存在差異[32-33]，比如：對西洋參內(nèi)生菌多樣性研究結(jié)果顯示西洋參根部的內(nèi)生菌種類最多，為13屬26種，而葉中內(nèi)生菌最少，僅為9屬16種。南藥植株高良姜不同組織中內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)存在顯著差異，以根莖最低，葉最高[34]。但是，目前尚沒有從不同組織部位去研究秦艽內(nèi)生菌結(jié)構(gòu)的相關(guān)報道。本研究從根、莖、葉、花中共得到細(xì)菌10株，經(jīng)鑒定歸屬于2門8屬；真菌3株，歸屬于2屬。其中莖部分離得到7屬，葉部分離得到7屬，根部分離得到9屬，花部分離得到3屬。實驗結(jié)果探明了麻花秦艽可培養(yǎng)內(nèi)生菌在其不同組織部位的分布規(guī)律。

同時，藥用植物活性成分生物合成與植物內(nèi)生菌的分布有緊密聯(lián)系，而內(nèi)生菌群也同樣受植物體內(nèi)活性成分的影響，兩者之間存在顯著相關(guān)性[34-35]。通過研究麻花秦艽可培養(yǎng)內(nèi)生菌及其優(yōu)勢菌株的數(shù)量與龍膽苦苷含量之間的相關(guān)性，弄清了可培養(yǎng)內(nèi)生菌結(jié)構(gòu)與麻花秦艽有效成分龍膽苦苷之間的相關(guān)關(guān)系。不僅內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌數(shù)量分別與麻花秦艽植株中龍膽苦苷的含量成極顯著正相關(guān)（P＜0.01）， 而且 優(yōu) 勢 內(nèi) 生 菌 QJ2、QJ6、QJ10、QJ11 和QJ13的數(shù)量也分別與麻花秦艽植株中龍膽苦苷的含量成極顯著正相關(guān)（P＜0.01，表7）。根據(jù)已有研究報道，內(nèi)生菌對植物活性成分的產(chǎn)生和積累途徑的影響主要有兩種方式：一是內(nèi)生菌能產(chǎn)生外源性誘導(dǎo)子，能快速、專一和選擇性地誘導(dǎo)藥用植物代謝過程中特定基因的表達(dá)，調(diào)控藥用植物活性成分的生物合成[36]；二是由于具有相同活性產(chǎn)物合成途徑的相關(guān)基因或者在共同生活環(huán)境中直接接觸而傳遞遺傳物質(zhì)[37-38]。易培養(yǎng)、生長速度快、生長周期短的自身合成藥用植物活性成分的微生物的研究和開發(fā)有希望成為解決秦艽資源緊缺和合理開發(fā)利用秦艽資源的有效途徑之一[15]。本課題組在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌QJ3和QJ9的發(fā)酵液對大腸桿菌、志賀菌和沙門菌均具有較強的抑制作用，化合物的分離純化及鑒定工作在進(jìn)一步研究中，以期獲得較高活性或者新的化合物。

目前，關(guān)于內(nèi)生菌對藥用植物活性成分的影響仍處在初步探索階段，相關(guān)的研究將為內(nèi)生菌對藥用植物活性成分積累的調(diào)控作用提供實踐基礎(chǔ)。因此，本研究通過對麻花秦艽不同組織部位中進(jìn)行可培養(yǎng)內(nèi)生菌的分離與鑒定，為麻花秦艽內(nèi)生菌資源進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。通過研究麻花秦艽內(nèi)生菌與其活性成分之間的相關(guān)性，有助于深入認(rèn)識藥材活性成分的形成。同時也為藥用植物活性成分的生產(chǎn)管理奠定理論和實踐基礎(chǔ)，如在秦艽的栽培管理中，接種合適的菌肥和提高其內(nèi)生菌總數(shù)量對秦艽活性物質(zhì)含量的提高將有積極的促進(jìn)作用。