楊妙峰，鄭盛華，席英玉，羅冬蓮，鐘碩良

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；2.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361013)

鎘(Cd)是已知的最易在體內(nèi)蓄積的環(huán)境污染毒物之一，具有致病、致癌和致突變作用，半衰期長達(dá)10～35年，是影響水產(chǎn)品尤其是具高富集特性的濾食性貝類食用安全的主要污染物之一[1-2]。食品中的污染物經(jīng)口攝入后僅有部分能通過消化作用從基質(zhì)中釋放出來，且只有釋放出來的部分(即生物可給量)可對機(jī)體產(chǎn)生毒性作用，而目前現(xiàn)行的檢測方法和限量標(biāo)準(zhǔn)主要針對的均是水產(chǎn)品中Cd的總量(即殘留量)分析，污染物膳食暴露評估也多基于食品中污染物的污染水平(外暴露量)而非污染物經(jīng)消化、吸收后到達(dá)組織產(chǎn)生毒性作用的劑量(內(nèi)暴露量)，因此可能會過高估計污染物的暴露水平[3]。體外仿生消化法能夠有效模擬胃腸道的物理化學(xué)環(huán)境，獲得經(jīng)口攝入的Cd進(jìn)入人體后生物可給率的可靠數(shù)據(jù)[4]，但多見于魚類[5]和藻類[6-7]等水產(chǎn)品食用風(fēng)險的研究，而貝類體內(nèi)重金屬生物可給率的報道相對較少，如趙艷芳等[8]探討了在胃腸仿生消化液作用下，櫛孔扇貝和菲律賓蛤仔體內(nèi)Cd的存在形態(tài)，并認(rèn)為該結(jié)果對評估貝類中Cd的食用安全性具有積極意義；洪雄業(yè)[9]、蔡艷等[10]、王增煥等[11]也分別利用體外仿生消化法獲得菲律賓蛤仔、縊蟶、鮑、牡蠣、血蚶等經(jīng)濟(jì)貝類體內(nèi)微量金屬元素的生物可給率并進(jìn)行健康風(fēng)險評價。

淺海貝類華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobills，以下簡稱扇貝)是對Cd富集能力較強(qiáng)、且抽檢時Cd含量易超標(biāo)的養(yǎng)殖貝類品種。本文以此為研究對象，采用體外仿生消化法，研究扇貝體內(nèi)組織的消化食糜中Cd存在的主要形態(tài)及影響因子，并對扇貝不同部位組織中Cd的生物可給率進(jìn)行分析，以期為扇貝的食用安全評價提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與試劑

儀器設(shè)備：原子吸收光譜儀(iCE 3500，ThermoFisher)，水浴恒溫振蕩器(THZ-82，常州國華電器有限公司)，高速離心機(jī)(5810R，Eppendorf)，微波消解儀(Mars 6，CEM)，pH/ISE測試儀(828型，Orion)，超純水系統(tǒng)(Milli-Q element A10，Millipore)。ICP-MS(Agilent 7700x)，工作參數(shù)：射頻功率1 550 W，等離子體氣流速15 L/min，輔助氣流速1.15 L/min，采樣時間1 320 s。HPLC(Agilent 1260)，分離條件：Agilent Bio SEC-5分離柱(300 A，7.8 mm×300 mm)及Agilent SEC-5保護(hù)柱(300 A，7.8 mm×50 mm)，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量80 μL；流動相：10 mmol/L Tris-HCl緩沖液，其中加入0.1 mol/L NaCl和0.03% NaN3，調(diào)節(jié)pH=7.5，0.45 μm濾膜過濾，超聲40 min除去溶解氧。通過G7205B等離子體色譜數(shù)據(jù)分析軟件控制的觸發(fā)接口實現(xiàn)HPLC和ICP-MS聯(lián)機(jī)。

胰液素(效價1∶4 000)、膽汁、牛血清白蛋白、α-淀粉酶(活力≥4 000 U/g)、脂肪酶(活力≥30 000 U/g)、黏液素、尿酸、胃蛋白酶(效價1∶30 000)、金屬硫蛋白(MT-Ⅱ，純度≥95%)、還原性谷胱甘肽(GSH，純度≥98%)和L型半胱氨酸(L-Cys，純度≥98%)等生化試劑均購于上海一基實業(yè)有限公司；氫氧化鈉、濃鹽酸、濃硝酸為優(yōu)級純；其余試劑均為分析純。GBW10024(GSB-15)扇貝成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為Cd總量測定的質(zhì)控樣，購自地球物理地球化學(xué)勘查研究所。GSB G 62040-90(4801)Cd標(biāo)準(zhǔn)溶液購自國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院。

MT-Ⅱ-Cd、GSH-Cd和Cys-Cd標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：在氮氣保護(hù)下，在MT-Ⅱ、GSH和Cys絕對過量的情況下加入Cd2+(螯合配比≥10∶1)，配制成200 μg/L(以Cd計)標(biāo)準(zhǔn)溶液用以確定保留時間。

1.2 樣品制備

2014年7月—2018年4月從廈門、漳州市場分批購得10批次扇貝樣品(S1～S10，各30只)。扇貝用超純水沖洗3遍后濾紙吸干，去殼勻漿，于-20℃冷凍保存。隨機(jī)選取其中6個扇貝樣品，分別取閉殼肌、性腺、內(nèi)臟、鰓瓣/外套膜等不同組織部位，并分別勻漿后于-20℃冷凍保存。

1.3 實驗設(shè)計

根據(jù)文獻(xiàn)配制體外仿生消化液[12]，稱取約1～2 g扇貝樣品(精確至0.001 g)，加入2.5 mL唾液37℃恒溫振蕩5 min，再加入15 mL胃液振蕩2 h，最后加入30 mL十二指腸液和10 mL膽汁振蕩7 h，8 000 r/min離心10 min(4℃)后取上清液用0.45 μm濾膜過濾，濾液(即仿生消化食糜)在4℃下保存待用，同步做消化食糜空白對照(Cd含量<0.2 μg/L)[8，12-13]。所有實驗平行2份，取平均值。

1.4 微波消解及Cd含量測定

準(zhǔn)確稱取2 g貝類鮮樣(精確至0.001 g)，加入10 mL濃HNO3靜置過夜，微波消解后用石墨爐原子吸收光譜儀(iCE 3500)測定樣品中Cd含量，同時做試劑空白對照。消化食糜用1% HNO3稀釋相應(yīng)倍數(shù)后測定Cd含量；消化殘渣全量轉(zhuǎn)移至消解罐，加入10 mL濃HNO3，微波消解后測定殘渣態(tài)Cd含量。

質(zhì)控樣-GBW10024扇貝標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Cd含量測定結(jié)果為(1.11±0.04)mg/kg，符合參考值(1.06±0.10)mg/kg要求，表明石墨爐原子吸收法測定Cd含量的方法準(zhǔn)確可靠。

1.5 扇貝體內(nèi)Cd形態(tài)的測定

標(biāo)準(zhǔn)譜圖(定性)：在氮氣保護(hù)下，分別配制200 μg/L(以Cd計)的MT-Ⅱ-Cd、GSH-Cd和Cys-Cd三種螯合態(tài)Cd標(biāo)準(zhǔn)溶液，各進(jìn)樣40 μL，經(jīng)HPLC分離后在ICP-MS進(jìn)行測定，并隨機(jī)選擇一個扇貝消化糜樣品進(jìn)行Cd形態(tài)分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

扇貝樣品Cd的最大生物可給率以全過程仿生消化后Cd的溶出率予以表征，代表經(jīng)胃腸道消化后Cd的最大釋放率，而Cd的溶出率為Cd的生物可給量與樣品含Cd總量的比值，即：

其中：C—消化食糜中溶解態(tài)Cd含量(μg/L)；V—消化食糜體積(L)；X—樣品Cd含量(μg/g)；m—稱樣量(g)。

其中：mi—解剖后i組織的質(zhì)量(g)，m0—全貝(去殼)質(zhì)量(g)。

扇貝i組織對全貝消化靡Cd的貢獻(xiàn)率(%)

使用Excel 2010和SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形制作。

2 結(jié)果

2.1 扇貝消化食糜中Cd的形態(tài)

MT-Ⅱ-Cd、GSH-Cd和Cys-Cd質(zhì)譜圖如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線(定量)：用200 μg/L(以Cd計)CdMT-Ⅱ-Cd繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，分別進(jìn)樣20、40、80 μL(Cd進(jìn)樣量x分別為0.004、0.008和0.016 μg)：Cd的響應(yīng)值y=4 563 214x(μg)+2 449，R2=1.000 0，對MT-Cd進(jìn)行定量分析。

扇貝消化食糜經(jīng)HPLC分離后檢測到2個Cd的信號峰(圖2)，保留時間分別為14.3和15.6 min，根據(jù)1.5中MT-Ⅱ-Cd、GSH-Cd和Cys-Cd標(biāo)準(zhǔn)溶液在相同分離條件下的保留時間(圖1，RT分別為14.5、15.6和16.4 min)，可判斷14.3 min處為MT-Cd，15.6 min處為GSH-Cd。分別用HPLC-ICP-MS和原子吸收光譜儀測定CdMT-Cd和消化食糜的Cd含量，測定值分別為42.6(以Cd計)和47.6 μg/L，因此MT-Cd是扇貝消化食糜中Cd最主要的形態(tài)(約占89.5%)。

2.2 扇貝及不同組織中Cd的生物可給率

2.2.1 扇貝Cd的生物可給率

由圖3可知，扇貝Cd含量范圍為1.41～3.89 μg/g(均值2.77 μg/g)，(單位質(zhì)量)生物可給量范圍則為0.582～2.10 μg/g(均值1.31 μg/g)，Cd的生物可給率(溶出率)范圍在36.5%～63.3%(均值47.9%)之間。其中Cd含量與生物可給率之間，Cd含量、生物可給率與生物學(xué)參數(shù)(長、寬、厚、體重)之間無統(tǒng)計學(xué)規(guī)律，相關(guān)性不強(qiáng)(P≥0.10)，個體差異明顯。

2.2.2 不同部位組織Cd的生物可給率比較

扇貝不同組織Cd含量的分布規(guī)律為內(nèi)臟>鰓瓣/外套膜≈閉殼肌>性腺(圖4)，內(nèi)臟Cd含量最高，約為其他組織的1.02～3.74倍(均值2.10倍)，(單位質(zhì)量)生物可給量則為其他組織的0.74～3.77倍(均值1.95倍)，內(nèi)臟和鰓瓣/外套膜中Cd的生物可給率略低于閉殼肌和性腺。同時，扇貝體內(nèi)各組織受自身Cd含量、Cd可給率及質(zhì)量分?jǐn)?shù)共同影響，對消化糜中Cd含量的貢獻(xiàn)率大小為閉殼肌>鰓瓣/外套膜>內(nèi)臟>性腺(圖5)，性腺最低，其余3種組織貢獻(xiàn)率相差較小?？傮w而言，閉殼肌對消化糜中Cd的貢獻(xiàn)率與其質(zhì)量分?jǐn)?shù)相當(dāng)，鰓瓣/外套膜和性腺的略低于其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而內(nèi)臟的貢獻(xiàn)率則高于對應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，使得質(zhì)量分?jǐn)?shù)相近的內(nèi)臟和性腺對消化糜中Cd的貢獻(xiàn)率表現(xiàn)為內(nèi)臟是性腺的2.32倍。

3 討論

3.1 扇貝體內(nèi)消化食糜中Cd存在的主要形態(tài)及其影響研究

扇貝消化食糜中Cd的形態(tài)主要是MT-Cd和GSH-Cd，MT-Cd是消化食糜中Cd最主要的形態(tài)。這可能是以下幾種因素綜合影響的結(jié)果：貝類體內(nèi)Cd的積累和貯存形式包括可溶性細(xì)胞漿與不溶性顆粒細(xì)胞兩大類，主要有與金屬硫蛋白(類金屬硫蛋白)或小分子量配位體(如GSH、Cys等)結(jié)合以及經(jīng)細(xì)胞代謝后被亞細(xì)胞顆粒膜包裹成金屬顆粒物等物質(zhì)[14-16]。仿生消化時，Cd絡(luò)合物在胃液強(qiáng)酸條件下(pH<1.2)發(fā)生解離，如50%Cd-MT發(fā)生解離的pH為2.5～3.5[17-18]，Cys-Cd在pH<4.0時也不能穩(wěn)定存在(絡(luò)合物極譜峰消失)[19]；隨著腸消化階段pH的升高(最終pH≈6.5)，在強(qiáng)酸性條件下解離出來的Cd將與消化食糜中的有機(jī)配體重新絡(luò)合。由于MT在中性條件下的穩(wěn)定性和對金屬的螯合能力均優(yōu)于GSH、Cys等小分子物質(zhì)[20-21]，表現(xiàn)出對Cd絕對的螯合競爭力，因此消化食糜中Cd的主要形態(tài)為MT-Cd。趙艷芳等[8]發(fā)現(xiàn)扇貝體內(nèi)的Cd主要以MT、GSH和Cys的絡(luò)合態(tài)存在，仿生消化后，在胃提取液(酸性)中僅發(fā)現(xiàn)未知的小分子有機(jī)Cd(Cd-X)，在扇貝腸提取液(即消化食糜)中發(fā)現(xiàn)Cd的主要形態(tài)為MT-Cd也證明了這一點。另一方面，中性條件下Cd與MT的結(jié)合能力是Zn的104倍[22]，因此腸消化階段Cd與有機(jī)配體重新絡(luò)合時，也能競爭取代仿生消化前MT-Zn中的Zn，生成MT-Cd，從而增加MT-Cd在消化食糜中Cd含量的比例。因此，扇貝消化食糜中Cd的形態(tài)可能與貝類體內(nèi)Cd的貯存形態(tài)、MT和GSH等有機(jī)配體及其Cd螯合物的穩(wěn)定性、Cd離子與其他金屬離子的競爭優(yōu)勢等因素有關(guān)。如圖3所示，不同扇貝樣品Cd生物可給率存在著個體差異，是否與貝類組織及消化糜中Cd的形態(tài)及分布有關(guān)，尚有待于進(jìn)一步實驗取證。

除了MT-Cd是消化食糜中Cd的主要形態(tài)外，與趙艷芳等[8]的實驗結(jié)論略有不同的是，本實驗消化食糜中還發(fā)現(xiàn)有少量GSH-Cd，而趙艷芳等發(fā)現(xiàn)的則是未知的Cd-X(分子量小于Cys-Cd)，這可能是因為后者制備的扇貝樣品經(jīng)過蒸熟步驟，蒸煮過程GSH會部分流失，加上仿生消化時，是將胃提取液取出約2/3再加入腸液和膽汁，因而消化食糜的最終pH值較高，導(dǎo)致GSH不易留存。

3.2 扇貝及不同組織中Cd的可給率比較及其影響研究

由于人體消化液組成和消化環(huán)境的多樣性和復(fù)雜性，體外仿生消化尚無通用方法，pH、消化液組成、停留時間、固液比、是否經(jīng)烹飪處理及烹飪處理方式等都是可給率的影響因素。本實驗中，扇貝體內(nèi)Cd的生物可給率在36.5%～63.3%(均值47.9%)之間，低于洪雄業(yè)測得的興化灣養(yǎng)殖貝類縊蟶、菲律賓蛤仔、鮑魚Cd可給率(范圍為53.8%～68.4%，均值61.3%)[9]以及王增煥等得出的牡蠣和蛤仔Cd的可給率(分別為76.8%和87.7%)[11]，而蔡艷等得到的象山、舟山、寧海3個海區(qū)的牡蠣、縊蟶、血蚶熟貝Cd的可給率范圍則在28.6%～69.6%之間[10]，除了與實驗方案設(shè)計不同有關(guān)外(如因仿生唾液、胃液、腸液和膽汁比例不同導(dǎo)致消化食糜最終pH不同，而pH是Cd可給率重要的影響因素之一[13])，還可能由于貝類體內(nèi)Cd的可給率本身具有種間差異，但這種差異是否與不同貝類體內(nèi)Cd的貯存形態(tài)有關(guān)，仍需后續(xù)進(jìn)一步開展相關(guān)研究。

如圖5所示，扇貝閉殼肌、性腺、鰓瓣/外套膜和內(nèi)臟對全貝Cd生物可給量的貢獻(xiàn)率均值分別為34.1%、10.9%、29.5%和25.4%，變異系數(shù)分別為13.8、55.1、20.0和34.8，性腺和內(nèi)臟變異系數(shù)較大可能與性腺和胃含物飽滿度(分別用相應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表征)有關(guān)。用SPSS 18.0探究各組織質(zhì)量分?jǐn)?shù)與相應(yīng)Cd可給率的關(guān)系(圖6)，結(jié)果顯示性腺質(zhì)量分?jǐn)?shù)與可給率呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.840，P<0.05)，內(nèi)臟質(zhì)量分?jǐn)?shù)與可給率呈顯著極正相關(guān)(R=0.996，P<0.01)，閉殼肌和鰓瓣/外套膜的質(zhì)量分?jǐn)?shù)則與可給率相關(guān)性較弱。扇貝屬于淺海貝類，餌料來源主要是海水懸浮顆粒中的浮游植物和有機(jī)碎屑，而浮游植物對Cd的富集能力較強(qiáng)[23]，內(nèi)臟質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，消化道中內(nèi)容物越多，Cd的可給率越高，說明攝食可能是扇貝吸收Cd的主要途徑。而性腺中Cd的可給率略高于其他組織，這可能是因為扇貝生殖系統(tǒng)對Cd污染的應(yīng)激反應(yīng)較敏感[14]，較高的可給率有利于Cd的轉(zhuǎn)運和排出，這也可能是性腺Cd含量較低的原因。同時，鰓瓣/外套膜和內(nèi)臟中Cd的可給率較低，則有利于Cd的解毒和貯存。

4 結(jié)論

1)扇貝通過胃腸道消化后Cd的最大可給率范圍在36.5%～63.3%之間(均值47.9%)，消化食糜中Cd的主要形態(tài)為MT-Cd和GSH-Cd。

2)扇貝不同組織Cd的分布規(guī)律為內(nèi)臟>鰓瓣/外套膜≈閉殼肌>性腺，鰓瓣/外套膜和閉殼肌是扇貝消化食糜中Cd含量的主要來源(占63.5%)。食用前若去除內(nèi)臟，可以減少約25%Cd的膳食攝入量(圖5 b)。