黃 峰 ， 丁振江 ， 孫紅霞 ， 張春江 ， 張 良 ， 張 泓 *

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（北京），北京100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 合肥食品營養(yǎng)與健康創(chuàng)新研究院，安徽 合肥 238000；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（哈爾濱），黑龍江 哈爾濱 151900）

動(dòng)物品種、性別、肌肉的部位和營養(yǎng)情況等都可以影響肉的嫩度，但本質(zhì)上影響嫩度改善的因素主要包括結(jié)締組織含量、肌節(jié)長度和肌原纖維蛋白的水解程度3個(gè)方面[1]。結(jié)締組織的含量主要影響肉的“本底硬度”，肌節(jié)長度主要在僵直過程中對(duì)肉嫩度產(chǎn)生影響，而肌原纖維蛋白的有限降解是成熟過程中肌肉嫩度得到改善的主要原因。目前，控制宰后嫩化的方法主要有化學(xué)、物理、生物和酶類嫩化法等，其中鈣激活酶體系是酶類嫩化法的主要研究對(duì)象[2]。鈣激活酶被認(rèn)為是宰后肌肉成熟過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的內(nèi)源酶類[3-4]。但最近研究發(fā)現(xiàn)除鈣激活酶外，細(xì)胞凋亡酶也參與了宰后肌肉的嫩化過程，成熟是多種內(nèi)源酶和調(diào)控因子協(xié)同作用的結(jié)果[5-7]。熱休克蛋白作為一種機(jī)體保護(hù)蛋白，在動(dòng)物被屠宰放血后，正常的生理狀態(tài)被打破，促使機(jī)體釋放熱休克蛋白而產(chǎn)生免疫應(yīng)答。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在肉品中的應(yīng)用，許多的小分子熱休克蛋白（small heat shock proteins，sHSPs） 在宰后肌肉中被檢測到，并發(fā)現(xiàn)與宰后肌肉嫩度、保水性等食用品質(zhì)變化具有顯著相關(guān)性，并被認(rèn)為可能是宰后肌肉成熟過程中的一個(gè)重要調(diào)控因子[8-9]。作者主要對(duì)小分子熱休克蛋白的種類、結(jié)構(gòu)與功能及對(duì)宰后肌肉成熟過程的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探討。

1 小分子熱休克蛋白的種類與結(jié)構(gòu)

熱休克蛋白是指生物體遭受外界高于其正常生長溫度或劇烈震動(dòng)時(shí)，新合成或過表達(dá)的一類保護(hù)機(jī)體自身的蛋白質(zhì)，又稱為脅迫蛋白。最早由遺傳學(xué)家Ritossa[10]在1962年研究果蠅唾液腺時(shí)發(fā)現(xiàn)。根據(jù)單聚體相對(duì)分子質(zhì)量大小和同源程度不同，可將熱休克蛋白分為 sHSPs，HSP 60，HSP 70，HSP 90及HSP110五大家族[11]。sHSPs是熱休克蛋白的亞單位之一，相對(duì)分子質(zhì)量在12 000～43 000之間，和其他熱休克蛋白相比，該類蛋白不需要ATP即能發(fā)揮作用。目前已在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了11種sHSPs，且在不同組織中表達(dá)不同（表1）[4]。Taylor等[12]依據(jù)其在組織中的表達(dá)把sHSPs分為兩類，一類是在所有組織中均表達(dá)；另一類是只在特定組織中表達(dá)。sHSPs作為一種重要的分子伴侶蛋白，結(jié)構(gòu)上高度保守，在氨基酸序列C末端具有一段由80～100個(gè)氨基酸殘基組成特定區(qū)域，因與 αβ-晶體蛋白具有很高的同源性，所以也稱為αβ-晶體蛋白區(qū)域[13]。除了一個(gè)靈活的C端，sHSPs還有一個(gè)連接著一個(gè)保守序列區(qū)域WDPF的N端[14]。sHSPs在體內(nèi)以高度有序的寡聚體形式存在，其寡聚體的結(jié)構(gòu)和組成均取決于每個(gè)小分子熱休克蛋白單體的a-晶體結(jié)構(gòu)以及C端和N端的長度和結(jié)構(gòu)。受到應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，sHSPs會(huì)發(fā)生解離或聚合，可形成相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)到2×105～8×105的低聚體復(fù)合物，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。

表1 小分子熱休克蛋白家族Table 1 Small heat shock proteins family

2 小分子熱休克蛋白的主要生物學(xué)功能

2.1 穩(wěn)定細(xì)胞骨架

細(xì)胞骨架由微絲、微管和中間纖維構(gòu)成，小熱休克蛋白具有穩(wěn)定和修復(fù)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的作用。HSP 27和aβ-晶狀體蛋白是sHSPs家族中的重要成員，有保護(hù)細(xì)胞骨架蛋白免受各種應(yīng)激因素的損傷、防止蛋白變性和使變性的蛋白恢復(fù)折疊等作用[15]。肌動(dòng)蛋白是微絲系統(tǒng)的主要組成部分，肌動(dòng)蛋白受溫度影響較大，在高溫下以不溶性形式聚集，破壞細(xì)胞骨架；而HSP 27能使不可溶性肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄?，從而穩(wěn)定細(xì)胞骨架[10]。此外，強(qiáng)氧化刺激通過產(chǎn)生ROS破壞細(xì)胞中的微絲系統(tǒng)，并導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白的解聚和片段化，而HSP 27可以通過抑制ROS的產(chǎn)生而保護(hù)細(xì)胞骨架[17]。

2.2 分子伴侶功能

分子伴侶作用是指能夠結(jié)合或釋放其他蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象，使得多肽鏈可以進(jìn)一步的折疊，多聚體的組合或降解以及細(xì)胞器蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的一種功能[18]。雖然sHSPs在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的分子伴侶作用機(jī)制還未研究清楚，但是sHSPs在細(xì)胞中的作用是不可否認(rèn)的。例如：HSP 27可以與甾體激素受體結(jié)合，不僅可以避免不良反應(yīng)的發(fā)生；結(jié)合物還可通過激活蛋白酶活性生成超氧化物歧化酶（SOD）等，增強(qiáng)細(xì)胞耐熱、抗理化反應(yīng)及抗氧化物損傷的功能；同時(shí)可提供結(jié)合蛋白，協(xié)同參與抗原遞呈、加工、“T”細(xì)胞導(dǎo)航以及免疫球蛋白裝配[19]等作用。HSP 22可與抗凋亡蛋白Bag3（又稱Bcl-2 interacting death suppressor）結(jié)合形成分子伴侶復(fù)合物[20]。HSP 22與HSP 27和其它分子伴侶相互作用，有刺激心肌細(xì)胞生存的作用[21]。研究表明，磷酸化程度較低的HSP 27多聚體的分子伴侶作用較強(qiáng)[22]。

2.3 抑制細(xì)胞凋亡

1972年Kerr[23]等首次提出細(xì)胞凋亡（apoptosis）的概念。細(xì)胞凋亡是指機(jī)體細(xì)胞收到凋亡信號(hào)的刺激后，在多個(gè)凋亡因子的相互作用下進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)并規(guī)律性完成的細(xì)胞程序性死亡，不同的凋亡誘導(dǎo)信號(hào)所形成的傳導(dǎo)途徑不同，目前發(fā)現(xiàn)的傳導(dǎo)途徑主要包括死亡受體通路（外通路）、線粒體通路（內(nèi)通路）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[24]。目前已有許多關(guān)于熱休克蛋白抑制細(xì)胞凋亡方面的報(bào)道，都是通過某種方式阻斷細(xì)胞凋亡通路。Mehlen等[25]探究到人類HSP 27表達(dá)可抑制Fas受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，即通過封閉接頭蛋白Daxx與細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶Ⅰ之間的相互作用；Concannon CG等[26]發(fā)現(xiàn)HSP 27可以與procaspase-3結(jié)合阻礙其活化而抑制細(xì)胞凋亡。上述都是由于阻斷了細(xì)胞凋亡的死亡受體通路即外通路而抑制細(xì)胞凋亡。Mehlen等發(fā)現(xiàn)sHSPs對(duì)腫瘤壞死因子（TNF-a）的作用主要依賴于解毒分子谷胱甘肽（GSH），阻止細(xì)胞色素 C（Cytochrome C，Cyt-C）的釋放，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡；Rane MJ等[27]研究發(fā)現(xiàn)HSP27可通過調(diào)控caspase-9抑制細(xì)胞凋亡；Mao[28]報(bào)道αβ-晶體蛋白在十字孢堿所致的凋亡過程中與bax，bcl-Xs結(jié)合，抑制兩者向線粒體的移位，從而起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。上述都是由于阻斷了線粒體通路即內(nèi)通路而抑制細(xì)胞凋亡。

2.4 心臟保護(hù)作用

研究表明血漿中HSP B1抗原濃度明顯提高主要表現(xiàn)在冠狀動(dòng)脈疾病患者中[29]，且機(jī)體血漿中HSP B1抗體濃度與是否患有該疾病及病情嚴(yán)重程度有明顯的相關(guān)性[30]。在缺血心肌組織中HSP B5表達(dá)量明顯增高，研究證明影響HSP B5以何種磷酸化形式參與缺血病理過程的因素較多，缺血時(shí)間可能是其一。Wang X等[31]研究發(fā)現(xiàn)向大鼠體內(nèi)注射帶有HSP B6基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有利于治療心肌梗死。有實(shí)驗(yàn)表明HSP B8的過表達(dá)可以增強(qiáng)線粒體產(chǎn)生NO，進(jìn)而保護(hù)心臟[32]。目前HSP保護(hù)缺血心肌組織的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3 小分子熱休克蛋白在成熟過程中的作用

3.1 小分子熱休克蛋白與宰后牛肉嫩度的關(guān)系

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在肉品中的應(yīng)用，許多的小分子熱休克蛋白在宰后肌肉中被檢測到。在哺乳動(dòng)物中共檢測到11種 sHSPs，其中HSP 27、HSP 20和αβ-晶體蛋白在骨骼肌中的表達(dá)量最高[8]。Ouali等[33]首次提出小分子熱休克蛋白可能對(duì)肉品質(zhì)有影響。各類小分子熱休克蛋白可以不同程度的抑制細(xì)胞凋亡，并通過分子伴侶作用維持細(xì)胞穩(wěn)定，此外，小分子熱休克蛋白還可以延緩肌肉的老化速度、減弱肌原纖維蛋白降解。宰后肌肉中小分子熱休克蛋白的表達(dá)和對(duì)肉品質(zhì)的影響機(jī)制還有待研究。

在嫩度預(yù)測因子的研究中發(fā)現(xiàn)HSP 27及其降解產(chǎn)物的含量可解釋91%的嫩度變化，高于之前發(fā)現(xiàn)的最高嫩度預(yù)測因子琥珀酸脫氫酶解釋的57.8%嫩度變化[34]，因此，被許多學(xué)者認(rèn)為HSP 27是最有可能參與嫩化過程的熱休克蛋白。目前，針對(duì)sHSPs的表達(dá)與宰后牛肉的嫩度的關(guān)系，有兩種對(duì)立的看法。Kim等[35]在宰后牛肉中發(fā)現(xiàn)HSP 27的表達(dá)與宰后牛肉嫩度之間存在正相關(guān)。Bernard等[36]研究表明由于sHSPs的分子伴侶作用，HSP 27和αβ-晶體蛋白的共同調(diào)節(jié)有利于肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的降解，進(jìn)而提高肉的嫩度。Morzel等[35]也發(fā)現(xiàn)HSP 27的表達(dá)與宰后牛肉嫩度之間存在正相關(guān)，并認(rèn)為HSP27可能是因?yàn)橐种频鞍拙奂?，從而有利于肌原纖維蛋白的降解，最終提高了宰后牛肉嫩度。相反，Lomiwes等[37]在不同嫩度的牛肉中發(fā)現(xiàn)HSP 27表達(dá)量顯著不同，HSP 27含量越高的牛肉其嫩度越差。Balan等[38]在宰后牛肉中發(fā)現(xiàn)HSP27發(fā)生降解，且降解程度顯著相關(guān)與肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解，并推測降解后的HSP27喪失了其保護(hù)功能，從而提高內(nèi)源酶對(duì)肌原纖維蛋白的水解能力。

3.2 sHSPs調(diào)控宰后牛肉嫩度的潛在機(jī)制

Bernard等[39]認(rèn)為HSP 27可以和αβ-晶體蛋白、HSP B8相互作用而影響宰后肌肉的嫩度。有研究表明HSP 27的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白的聚合，提高肌動(dòng)蛋白微絲的穩(wěn)定性，而肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的降解和宰后肌肉的嫩度有密切聯(lián)系，推測肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的降解影響肉的質(zhì)地，肌動(dòng)蛋白的降解有利于宰后肌肉的嫩化，并且發(fā)現(xiàn)肌球蛋白輕鏈II和磷酸丙糖異構(gòu)酶I也和肌肉嫩度有明顯的聯(lián)系。此外，HSP 27也是一種抗細(xì)胞凋亡蛋白，可以和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的關(guān)鍵控制蛋白結(jié)合，通過影響細(xì)胞凋亡的進(jìn)程進(jìn)而影響宰后肌肉的嫩度。

研究表明：pH值從7.4降低到6.5，會(huì)伴隨著αβ-晶體蛋白和肌原纖維蛋白的結(jié)合程度增加，也意味著肌肉中sHSPs濃度的降低是和結(jié)合肌原纖維蛋白有關(guān)聯(lián)[40]。通過體外模擬實(shí)驗(yàn)，將αβ-晶體蛋白添加到肌原纖維蛋白提取物中會(huì)降低肌間線蛋白和肌聯(lián)蛋白的降解，進(jìn)一步可以說明αβ-晶體蛋白可以作為μ-鈣激活酶的底物，并競爭性的抑制μ-鈣激活酶的活性[41]，進(jìn)而影響肉的嫩度，而αβ-晶體蛋白對(duì)宰后肌肉嫩化的作用機(jī)制還有待研究。

3.3 pH值對(duì)sHSPs調(diào)控作用的影響

最近的研究還發(fā)現(xiàn)宰后肌肉的極限pH值（pHu）與HSP表達(dá)及嫩度變化相關(guān)，Pulford等[41]認(rèn)為pHu的降低會(huì)導(dǎo)致HSP 20、HSP 27和 αβ-晶體蛋白在肌肉中的濃度降低，并且在處于中間pHu的宰后肌肉中可以檢測出sHSPs，在低pHu或高pHu條件下，只能檢測出很少的sHSPs，推測損失的部分sHSPs是由于生成了由磷酸化或脫磷酸化的sHSPs、ATP以及信號(hào)傳導(dǎo)等控制的低聚體絡(luò)合物。pHu在5.8～6.0之間牛肉其嫩度較其他pH范圍的差，這種嫩度差異可能是由于pH改變了HSP 27對(duì)鈣激活酶的水解活性，最終造成鈣激活酶對(duì)肌原纖維蛋白的水解程度不同所造成[37，42-43]。也有學(xué)者推測在中間pHu，內(nèi)源性蛋白水解活動(dòng)和高濃度sHSPs的共同作用會(huì)穩(wěn)定肌原纖維蛋白，并阻礙肌原纖維蛋白的水解，進(jìn)而降低肉的嫩度[43]。此外，Lomiwes等[43]研究表明高pHu條件下的sHSPs濃度高于低pHu條件下sHSPs的濃度，盡管如此，在高pHu條件下，sHSPs也會(huì)隨著肉品質(zhì)的成熟發(fā)生降解，可能是由于在此pH是μ-鈣激活酶的最佳活性條件。另外，許多學(xué)者利用蛋白質(zhì)組學(xué)在宰后肌肉中檢測到HSP 27不同等電點(diǎn)的異構(gòu)體[44]，而磷酸化作為改變蛋白等電點(diǎn)的一種常見方式值得關(guān)注。

4 展望

目前有關(guān)熱休克蛋白27在細(xì)胞培養(yǎng)或在病理狀態(tài)下（如神經(jīng)肌肉失調(diào)、肌炎、肌萎縮等）下的調(diào)控機(jī)制研究已相對(duì)成熟。許多學(xué)者最近發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白27與宰后肌肉嫩度之間存在顯著相關(guān)性，但對(duì)這種相關(guān)性的內(nèi)在機(jī)制存在兩種推測：一是HSP 27由于降解或沉淀喪失保護(hù)功能，從而提高內(nèi)源酶水解能力；另一種是HSP 27可能抑制肌肉蛋白聚集更有利于其降解。目前有關(guān)HSP 27在宰后嫩化過程中的調(diào)控機(jī)制研究還較少，直接的支撐數(shù)據(jù)更是有限，特別是宰后肌肉嫩化過程中HSP 27對(duì)肌原纖維蛋白、細(xì)胞凋亡酶和鈣激活酶的結(jié)構(gòu)修飾及修飾后肌原纖維蛋白對(duì)肌肉內(nèi)源酶水解敏感性變化以及修飾后鈣激活酶或細(xì)胞凋亡酶酶對(duì)肌原纖維蛋白的水解活性變化等。因此，熱休克蛋白27在宰后肌肉嫩化過程中的調(diào)控機(jī)制有待深入研究，從而豐富和發(fā)展肉的嫩化理論，進(jìn)一步完善嫩化過程中的內(nèi)源酶調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新的理論依據(jù)。