李 望， 耿 燕*， 任怡琳， 史勁松， 許正宏

（1．江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2．江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

研究證明，腸道微生物的群落組成和多樣性改變會影響腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，促進結(jié)腸炎的發(fā)展[1-4]。猴頭菌（Hericium erinaceus）是著名的藥食用真菌，具有良好的抗氧化活性[5]，并對結(jié)腸炎的治療[6]、胃黏膜的保護[7]等具有重要作用。鑒于猴頭菌對消化系統(tǒng)的保護作用，作者初步考察猴頭菌粉對DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的治療效果，并利用變性梯度凝膠電泳技術(shù)從腸道微生物的角度探討猴頭菌粉對結(jié)腸炎小鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6雄性小鼠：6周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2 實驗器材

1.2.1 材料與試劑猴頭菌粉：江蘇省神華制藥有限公司提供；糞便隱血試劑盒：南京森貝伽公司產(chǎn)品；H&E染色試劑盒：上海碧云天公司產(chǎn)品；蛋白酶K：美國Thermo公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒：上海捷瑞公司產(chǎn)品；DNA測序和引物合成服務(wù)：上海生工提供。

1.2.2 儀器倒置顯微鏡：日本Nikon公司產(chǎn)品；低溫高速離心機：德國Epperdorf公司產(chǎn)品；振蕩恒溫金屬?。荷虾Ｒ缓愎井a(chǎn)品；核酸濃度測定儀：美國Thermo公司產(chǎn)品；PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)和變性梯度凝膠電泳儀：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的建立和給藥方法參照文獻方法[8]建立DSS小鼠結(jié)腸炎模型。C57BL/6雄性小鼠于實驗環(huán)境適應(yīng)一周后隨機分為4組，每組8只。正常對照組（NC）：飲食飲水為正常飼養(yǎng)條件；DSS模型組（MC）：2%DSS溶液替代飲用水，飲食條件不變；HE低劑量組（HEL）：小鼠自由攝取2%DSS溶液，同時每天灌胃猴頭菌粉溶液，劑量為250 mg/kg；HE 高劑量治療組（HEH）：飲用 DSS溶液，同時每天灌胃猴頭菌粉溶液，劑量為500 mg/kg。具體分組和實驗步驟如圖1所示。

1.3.2 小鼠病活動指數(shù)評分（Disease activity index，DAI） 記錄各組小鼠的體重并監(jiān)測小鼠糞便形狀和隱血情況，參照文獻[9]進行DAI評分。小鼠同時接受猴頭菌粉和2%DSS小鼠作用7 d后犧牲，分離結(jié)腸組織，記錄結(jié)腸長度并收集腸道內(nèi)容物。

圖1 猴頭菌粉對DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的治療方法Fig.1 ProcedureofDSS-induced colitisin miceadministrated with Hericium erinaceus

1.3.3 小鼠結(jié)腸病理檢查解剖取新鮮的結(jié)腸組織固定于福爾馬林溶液，制作病理組織切片，在顯微鏡下觀察結(jié)腸組織炎癥細胞浸潤、腺體和隱窩結(jié)構(gòu)等情況。

1.3.4 結(jié)腸內(nèi)微生物總DNA的提取樣品中加入500 μL 的裂解緩沖液 （50 nmol/L Tris-HCl，100 nmol/L EDTA，100 nmol/L NaCl，1 g/dL SDS）和2.5 μL蛋白酶K，55℃恒溫振蕩器震蕩3 h后，與500 μL水飽和酚—三氯甲烷—異戊醇 （體積比為25∶24∶1）混勻離心取上清，兩倍體積乙醇與上清混勻后離心取沉淀DNA，用體積分數(shù)70%乙醇洗滌DNA，揮發(fā)干乙醇后加入TE緩沖液 （10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）溶解 DNA，測定DNA濃度。

1.3.5 16S rDNA V3區(qū)PCR擴增將16S rDNA V3區(qū)基因采用通用引物進行擴增，引物序列如下：上游引物5'-CGC CCG CCG CGC GCC GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3'；下游引物 5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'。 Touch-down PCR 程序：94 ℃，3 min；94 ℃，1 min；65 ℃，1 min；72 ℃，1 min；從第二次循環(huán)開始，每個循環(huán)退火溫度降低1℃，退火溫度達到55℃后，72℃延伸6 min；4℃，∞。Touchdown PCR產(chǎn)物進行Recondition PCR，程序為：94℃，3 min，94 ℃，1 min；55 ℃，1 min；72 ℃，1 min，6次循環(huán)后，72℃延伸6 min；4℃，∞。

1.3.6 變形梯度凝膠電泳 （PCR-DGGE）采用變形梯度凝膠電泳儀進行DGGE，凝膠濃度為30～50 g/dL，60℃下200 V電泳4 h。SYBR GreenⅠ染料對凝膠進行染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用Quantity one軟件分析圖譜，構(gòu)建PCR-DGGE的聚類分析圖。

1.3.7 DGGE條帶分析切下含有目的DNA片段的凝膠，加入20 μL無菌ddH2O于滅菌離心管中搗碎，4℃過夜。取進行方法1.2.5中的Touch-down PCR，其中上游引物5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3'；下游引物5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'。PCR產(chǎn)物進行膠回收，連接，轉(zhuǎn)化到PMD19-T感受態(tài)細胞中，在添加氨芐的平板上隨機挑取轉(zhuǎn)化子接入含有氨芐的LB搖瓶培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～16 h后進行菌落PCR驗證，通用引物序列為M13-47和 RV-M，PCR程序同上述 Recondition PCR程序方法，選取含有目的基因的轉(zhuǎn)化子菌液，送樣由上海生工進行測序，序列在Gen Bank數(shù)據(jù)庫中進行同源性比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 猴頭菌粉對小鼠結(jié)腸炎的治療效果

2.1.1 猴頭菌粉對小鼠體質(zhì)量的影響觀察小鼠的活動狀況可以發(fā)現(xiàn)，正常小鼠飲食飲水及活動均正常，無便血；模型組小鼠出現(xiàn)便血、弓背、活動減少等現(xiàn)象。檢測小鼠實驗期間的體重變化，由圖2所示，正常組小鼠的體質(zhì)量變化不大，而模型組小鼠的體重在0～3 d時波動不大，但從第4天開始，體質(zhì)量變化呈現(xiàn)急劇下降的趨勢；與正常組相比，猴頭菌粉低、高劑量兩組的小鼠體質(zhì)量整體也呈下降趨勢，但是變化趨勢較DSS模型組有所減緩。

圖2 猴頭菌粉對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of Hericium erinaceus on body weight of mice with colitis

2.1.2 猴頭菌粉對小鼠結(jié)腸長度的影響如圖3所示，正常小鼠的結(jié)腸長度在6.7～7.3 cm，當小鼠接受DSS刺激后，引發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎，其結(jié)腸長度為4.1～4.8 cm，較正常組明顯縮短（###p＜ 0.001）；接受猴頭菌粉低劑量治療的小鼠，其結(jié)腸長度增長至5.5～5.9 cm，猴頭菌粉高劑量組小鼠的結(jié)腸長度為6.1～6.4cm，兩組的結(jié)腸長度較模型組均明顯增加（**p＜ 0.001，***p＜ 0.001），且高劑量猴頭菌粉治療效果更佳。

圖3 猴頭對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響Fig.3 Effect of Hericium erinaceus on colon length of mice with DSS-induced colitis

2.1.3 猴頭菌粉對小鼠DAI的影響如圖4所示，正常組小鼠體質(zhì)量波動不大，偶有稀便，而模型組小鼠的體質(zhì)量急劇下降，糞便出現(xiàn)肉眼可見的含血情況，因此其DAI評分極顯著增加（###p＜0.001）；與模型組小鼠相比，HEL和HEH兩組小鼠的糞便含血情況得到明顯改善，且體質(zhì)量下降趨勢得到減緩，兩組的DAI評分明顯降低（**p＜0.001，***p＜0.001）。這說明，猴頭能改善DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的臨床癥狀，對結(jié)腸炎有良好的治療效果。

圖4 猴頭菌粉對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠DAI評分的影響Fig.4 Effect of Hericium erinaceus on DAI score of mice with DSS-induced colitis

2.1.4 小鼠結(jié)腸組織病理切片觀察由病理切片圖5可以看出，正常組小鼠基本沒有出現(xiàn)炎性細胞浸潤的情況，黏膜沒有糜爛且無潰瘍形成，隱窩和腺體結(jié)構(gòu)保持完整且排列規(guī)則；由于DSS的刺激作用，在模型組小鼠的結(jié)腸組織中，隱窩和腺體的正常結(jié)構(gòu)被破壞，觀察發(fā)現(xiàn)大量炎性細胞浸潤到黏膜層；與模型組相比，HEL和HEH兩組的黏膜損傷程度小，腺體結(jié)構(gòu)破壞較輕，炎性細胞的數(shù)量和浸潤深度都顯著減少。這表明，猴頭菌粉可以修復(fù)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸黏膜損傷，減輕腸道炎癥反應(yīng)，保護結(jié)腸組織。

圖5 小鼠結(jié)腸組織病理切片（H&E染色，×200）Fig.5 Histopathological sections of colon （H&E staining，×200）

2.2 猴頭菌粉對小鼠腸道菌群的影響

2.2.1 腸道微生物16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE圖譜分析PCR-DGGE技術(shù)是分析復(fù)雜微生物組成的簡便手段，在DGGE圖譜中，每一個條帶代表一類細菌，條帶的數(shù)量及其灰度分別代表細菌的多樣性和相對豐度[10]。由圖6可以看出，DGGE技術(shù)可以有效反應(yīng)腸道菌群的多樣性，與正常組相比，模型組條帶數(shù)量沒有明顯減少，說明腸道菌群的多樣性沒有明顯變化，但是條帶的整體灰度明顯降低，說明其腸道菌群的豐度減少。模型組中條帶A的灰度明顯增加，條帶B和C的灰度減少，說明在結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群中，條帶A代表的微生物相對豐度增加，條帶B和C代表的微生物相對豐度減少，而與模型組相比，HEL和HEH兩組中條帶A的灰度降低，條帶B和C的灰度整體呈增加趨勢，猴頭菌粉能調(diào)節(jié)由結(jié)腸炎引起的腸道菌群失調(diào)，維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

圖6 腸道微生物16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE指紋圖譜Fig.6 DGGE profiles of intestinal microbiota in V3 region

2.2.2 PCR-DGGE圖譜聚類分析如圖7顯示，采用非加權(quán)成對算術(shù)平均法UPGMA分析腸道微生物PCR-DGGE圖譜時發(fā)現(xiàn)，各組樣本都能夠有效的聚為一類，由于個體差異，個別樣品出現(xiàn)不同。正常組和模型組的相似性降低為50%，說明發(fā)生結(jié)腸炎小鼠的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)與正常組小鼠存在顯著差異；HEL和HEH兩組能夠與模型組區(qū)分，并與正常組聚類，相似性可達到64%，說明接受猴頭菌粉治療的小鼠，其腸道微生物群落向正常組接近。

2.2.3 微生物特異性分析根據(jù)DGGE圖譜發(fā)現(xiàn)，條帶A、B和C的灰度與正常組相比，發(fā)生顯著變化，于是將3個條帶測序并在GenBank中進行同源性比對分析，結(jié)果顯示條帶A為Clostridium cocleatum（99%）， 條 帶 B 為Akkermansia muciniphila（100%）， 條帶 C 為Barnesiella intestinihominis（99%）。

圖7 腸道微生物16S rDNA V3區(qū)DGGE圖譜聚類分析Fig.7 UPGMA analysis on DGGE profiles of intestinal microbiota in C57BL/6 mice

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病原因及相關(guān)機制還未有確切結(jié)論，但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生、發(fā)展與腸道微生物的作用密不可分[11]。作者初步考察了猴頭菌粉對小鼠結(jié)腸炎的治療效果，并利用PCRDGGE技術(shù)，分析猴頭菌粉對結(jié)腸炎小鼠腸道微生物的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，猴頭菌粉對結(jié)腸炎具有良好的治療效果。經(jīng)過治療的小鼠飲食和活動情況得到改善，體重下降趨勢減緩，DAI評分降低。觀察結(jié)腸的病理組織切片可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)生結(jié)腸炎的小鼠結(jié)腸中出現(xiàn)大量炎性細胞的浸潤和杯狀細胞缺失的現(xiàn)象，隱窩腺體嚴重變形或消失，治療組的小鼠結(jié)腸隱窩結(jié)構(gòu)清晰可見，腺體排列整齊，但是仍然有不少炎性細胞浸潤。陳敏等[12]人研究發(fā)現(xiàn)猴頭提取物顆?？梢愿纳茩C體自由基水平來修復(fù)三硝基苯磺酸誘發(fā)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎。李桂珍[13]、周中銀[14]等人也在臨床水平上證實了猴頭菌提取物對潰瘍性結(jié)腸炎具有良好的治療效果。

通過分析PCR-DGGE指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸炎小鼠與正常組小鼠的腸道微生物相似性為50%，且圖譜中大部分條帶灰度降低，說明結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生一定改變，菌群豐度降低，這與Zhang等[15]報道的結(jié)果一致。經(jīng)過測序并在Gen Bank中進行比對發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸炎小鼠腸道菌群中Clostridium cocleatum含量高于正常水平，治療組中該菌的生長繁殖能夠得到有效抑制。Erja Malinen[16]等研究發(fā)現(xiàn)腸易激綜合癥 （IBS）患者胃腸內(nèi)C.cocleatum的含量明顯高于健康人群。Bibiloni等[17]利用PCR-DGGE技術(shù)分析腸炎小鼠糞便樣品，研究結(jié)腸炎發(fā)生過程中小鼠腸道微生物的變化，研究結(jié)果顯示，小鼠腸道內(nèi)C.cocleatum含量顯著高于普通小鼠。這說明C.cocleatum與腸道疾病的發(fā)生相關(guān)，經(jīng)DSS誘導(dǎo)引發(fā)腸炎疾病后的小鼠，其腸道內(nèi)環(huán)境發(fā)生了變化，促進C.cocleatum快速繁殖。Akkermansia muciniphila在結(jié)腸炎小鼠內(nèi)的含量降低，治療組中該菌的相對豐度增加。Everard等[18]研究發(fā)現(xiàn)當腸道粘液層的A.muciniphila含量增加時，其對維持腸道內(nèi)平衡，抑制飲食誘導(dǎo)的黏膜屏障厚度減少等具有重要作用。同時，A.muciniphila能夠增強腸上皮細胞的單層完整性，從而對受損腸道屏障起到一定的增強和保護作用[19]。Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)DSS誘導(dǎo)后的小鼠腸道中A.muciniphila含量下降，促進了結(jié)腸炎的發(fā)展。A.muciniphila含量減少，影響了炎癥腸道粘膜和屏障的修復(fù)，加劇了結(jié)腸炎的發(fā)展，而猴頭菌粉的治療可以促進A.muciniphila生長繁殖，使其發(fā)揮保護腸道粘膜的功能，改善腸道炎癥癥狀。Sasso等[20]研究發(fā)現(xiàn)Barnesiella intestinihominis存在于人類和小鼠腸道中，其含量在IBD患者腸道中顯著減少。Zhao等[21]發(fā)現(xiàn)在抗生素處理后的腸道微生物中B.intestinihominis含量減少，短鏈脂肪酸、初級膽汁酸的代謝水平也出現(xiàn)顯著降低。治療組小鼠腸道中由DSS攝入引起B(yǎng).Intestinihominis含量降低情況有所改善，說明猴頭菌粉能緩解腸道細菌紊亂的情況，維持機體代謝平衡。

4 結(jié) 語

猴頭菌粉對DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有良好的治療效果，同時在一定程度上改善結(jié)腸炎小鼠腸道菌群紊亂的情況。DSS的攝入擾亂了腸道細菌的群落結(jié)構(gòu)，使得結(jié)腸炎小鼠腸道的菌群豐度低于正常水平，C.cocleatum菌群相對含量增加，猴頭菌粉促進了A.muciniphila等有益微生物的生長，減輕腸道炎癥反應(yīng)，從而在炎癥性腸病的預(yù)防和治療中發(fā)揮功效。猴頭可以作為一種保健食品發(fā)揮改善潰瘍性結(jié)腸炎的作用，但是具體的作用機制仍待進一步研究。