張平平，喜多島敏彥，王 寧，高曉冬，中西秀樹

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

硫元素在很多細胞代謝過程中扮演著重要的角色，參與細胞對外界的壓力反應（如谷胱甘肽）、細胞內(nèi)酶反應、次級代謝過程（葡糖異硫氰酸鹽）等[1-2]。同樣的含硫氨基酸作為細胞維持生長代謝的基礎化合物也具有重要作用。在所有微生物中，合成含硫的氨基酸第一步均是從培養(yǎng)基中吸收無機硫，并通過一系列還原反應把無機硫還原成還原態(tài)的硫原子（S2-）[3]，然后再合成有關的含硫氨基酸。

酵母作為一種硫酸鹽還原菌，進化出了一系列利用自然界中無機硫合成自身代謝所需的有機硫化物的代謝途徑，如半胱氨酸、甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸等。同樣的，酵母也可以直接從培養(yǎng)基中吸收已有的有機硫化物如半胱氨酸、甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸等，從而進一步合成蛋白質、多肽、GSH等。

細胞利用無機硫合成含硫氨基酸的過程一般可分為兩種：還原態(tài)的S2-與O-乙酰同型絲氨酸（O-Acetyl-L-Homoserine OAH）生成同型半胱氨酸，此過程叫OAH途徑。另外一條途徑則是S2-與O-乙酰絲氨酸（O-Acetyl-L-Serine OAS）生成半胱氨酸，這個過程叫OAS途徑[4]。如圖1（a）釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）只有 OAH 途徑，并且生成的同型半胱氨酸轉化為半胱氨酸 （轉硫途徑）或者半胱氨酸轉化為同型半胱氨酸 （逆轉硫途徑）[5]，圖 1（b）中多型漢遜酵母（Hansenula polymorpha）除了具有與釀酒酵母類似的轉硫途徑與逆轉硫途徑外只有 OAS途徑。圖 1（c）中栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）含有 OAS途徑和OAH途徑，但是只有存在逆轉硫途徑[6-10]。

作者根據(jù)以上所描述的酵母與絲狀真菌的含硫氨基酸的生物合成途徑相關基因信息，對畢赤酵母基因組信息分析發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母細胞中可能同時存在OAS途徑、OAH途徑、轉硫途徑及逆轉硫途徑。

圖1 不同類型酵母含硫氨基酸生物合成途徑Fig.1 Different pathways of sulfur amino acid synthesis and transsulfuration in yeast species

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒、培養(yǎng)基

菌株：畢赤酵母SMD1186（作者所在實驗室保存）及以SMD1168為出發(fā)菌株構建的突變型菌株見表1。

質 粒 ：pBlueScriptIISK （+ ）；pRS305K；pRS306H。

培養(yǎng)基：YPD （10 g/L酵母提取粉，20 g/L蛋白胨A，20 g/L葡萄糖），缺陷型培養(yǎng)基2×SC液體培養(yǎng)基（13.4 g/L無氨基酸酵母氮源，40 g/L葡萄糖）。用于基因敲出篩選的YPD抗性平板中，潮霉素及G418的終質量濃度分別為0.3 g/L和0.2 g/L。B培養(yǎng)基（不含任何硫源的合成培養(yǎng)基，可根據(jù)需要在B培養(yǎng)基中加入2 mol/L的無機硫源硫酸銨或者0.2 mol/L的有機硫如甲硫氨酸、半胱氨酸、胱硫醚作為硫源）。固體B培養(yǎng)基中用1 g/dL的瓊脂糖代替瓊脂以避免引入硫元素。根據(jù)SMD1186的表型，在培養(yǎng)基中補充20 mg/L組氨酸以維持酵母的基本生長需求。

表1 本研究所用菌株Table 1 P.pastoris strains used in this study

1.2 試劑與溶液配制

潮霉素 B（Hygromycine B）：英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；G418：BBI Life sciences；硒代甲硫氨酸：L-Se-methionine，Sigima；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒、質粒小量抽提試劑盒：生工生物工程（上海）有限公司；DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶：TaKaRa；48孔板：常州英德生物科技有限公司；96孔板：依科賽生物科技有限公司。

STES buffer：0.5 mol/L NaCl，0.2 mol/L Tris·HCl（pH 7.6），0.01 mol/L EDTA（pH 8.0），1g/L SDS 。TE buffer ：Tris·HCl （pH 7.6），0.01 mmol/L EDTA（pH 8.0）

1.3 主要儀器

PCR儀器：日本TaKaRa公司；紫外分光光度計：美國GE；冷凍干燥機：日本EYELA；移液槍、臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf；電轉儀GenePulser Xcell及電極杯：美國 Bio-Rad；Nano drop 2000 spectrophotometer： 賽默飛 ；ImageQuant TMLAS 4000 mini：購于美國 GE。

1.4 含硫氨基酸生物合成途徑相關基因敲除模板的構建

畢赤酵母基因序列來自于 JGI（http：//genome.jgi.doe.gov/Picpa1/Picpa1.home.html）。構建基因敲除模板時，首先通過聚合酶鏈式反應技術（PCR）分別擴增得到目標基因起始密碼子上游和終止密碼子下游各500 bp的堿基序列，并通過基因克隆技術將500 bp的同源臂連接到選擇標記基因的啟動子前和終止子后，最終得到兩端含有500 bp的同源臂、中間為選擇標記基因的敲除模板。最后通過PCR得到模板DNA用于目標基因的敲除。根據(jù)標準的畢赤酵母基因敲除方法敲除相應的目標基因[11]。

1.5 畢赤酵母轉化及重組子的篩選

1.5.1 畢赤酵母電轉感受態(tài)的制備從平板上挑取單菌落接種到5 mL的YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，12 h后轉接至50 mL的YPD液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)至OD600=1.3～1.5。 4℃、5 000g離心5 min，收集細胞，用40 mL預冷的ddH2O洗兩次，5 000g離心5 min，收集細胞，用20 mL預冷的1 mol/L山梨醇重懸，4℃、5 000g離心5 min，收集細胞，最后用1 mL預冷的1 mol/L山梨醇重懸備用[12]。

1.5.2 酵母轉化取80 μL電轉感受態(tài)與20 μg的PCR產(chǎn)物混勻置于預冷的0.2 cm電極杯中，冰上放置5 min，用GenePulser Xcell電轉儀在1 500 V、25 μF、200 Ω、5 ms條件下電擊，立即加入 1 mL 預冷的1 mol/L山梨醇，用YPD液體培養(yǎng)基預培養(yǎng)3 h后收集細胞，涂布在篩選平板上[12]。

1.5.3 PCR篩選重組子從篩選平板上選取20個單菌落接種培養(yǎng)在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，收集 2 mL菌液，用 500 μL STEs buffer重懸，9 000g離心 1 min，收集細胞，加入 30 μL STEs buffer與適量的玻璃珠，振蕩破碎3 min后加入200 μL ddH2O 與 200 μL 苯酚氯仿異戊醇（25∶24g1），振蕩2 min，15 000g離心 5 min后， 取 150 μL上清液，加入 15 μL 3 mol/L 醋酸鈉（pH 5.2）和 375 μL 無水乙醇，4℃、15 000g離心5 min，去上清液，加入500 mL 70%乙醇，4℃、15 000g離心5 min，去上清液，60℃干燥后加入適量TE buffer，最后取1 μL基因組用于PCR驗證。

1.6 突變菌株表型驗證實驗

將畢赤酵母突變型菌株與野生型菌株接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基，30℃過夜培養(yǎng)。取OD600=0.5的細胞懸液，離心收集細胞并用ddH2O洗滌兩遍，最終用1 mL ddH2O重懸細胞。取3 μL菌液，在B培養(yǎng)基或者添加了相應硫源的B培養(yǎng)基平板上點板，30℃培養(yǎng)直到長出適當大小的菌落，用以驗證表型。

1.7 Ppcys3Δ缺陷型菌株的硒代甲硫氨酸 （Semethionine）抗性實驗

將Ppcys3Δ菌株與野生型菌株接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。取OD600=1的細胞懸液1 mL，離心收集細胞并用ddH2O洗滌兩遍。用ddH2O稀釋菌體濃度至OD600=0.2，并以終濃度OD600=0.05的細胞量接種于48孔板中，在含有不同濃度硒代甲硫氨酸的SC甲硫氨酸缺陷型液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。取200 μL菌液轉移至96孔板中，并用酶標儀測細胞濃度，以驗證菌株對硒代甲硫氨酸抗性。

2 結果與分析

2.1 生物信息學分析畢赤酵母的含硫氨基酸生物合成途徑

根據(jù)JGI畢赤酵母基因組信息庫信息以及已知的幾種酵母和絲狀真菌的含硫氨基酸生物合成途徑相關基因信息，我們在畢赤酵母中發(fā)現(xiàn)了OAH途徑、OAS途徑、轉硫途徑及逆轉硫途徑相關酶的同源序列，因此作者模擬構建了畢赤酵母含硫氨基酸合成途徑，見圖2。

根據(jù)已有的研究表明，真菌的OAS途徑首先是具有O-乙酰絲氨酸轉移酶的Sat1p將底物絲氨酸O-乙?；?O-乙酰絲氨酸 （O-Acetyl-LSerine），然后具有半胱氨酸合成酶活性的Cys1p利用S2-與O-乙酰絲氨酸合成半胱氨酸。通過運用已知真菌的Sat1p及Cys1p為模板檢索畢赤酵母基因編碼的蛋白質序列，發(fā)現(xiàn)在畢赤酵母中存在Sat1p及Cys1p的同源序列，這一結果暗示在畢赤酵母中可能存在OAS途徑。

根據(jù)已有報道真菌的OAH途徑：同型絲氨酸在Met2p（O-乙酰同絲氨酸轉移酶）的催化作用下生成O-乙酰同型絲氨酸 （O-Acetyl-LHomoserine），而后Met17p（同型半胱氨酸合成酶）利用S2-與O-乙酰同型絲氨酸為底物合成同型半胱氨酸。因此利用已知真菌的Met2p及Met17p為模板檢索畢赤酵母的蛋白質序列，發(fā)現(xiàn)畢赤酵母中存在Met17p及Met2p的同源序列。這一結果表明，在畢赤酵母中可能存在OAH途徑。

將畢赤酵母的PpSat1p與多型漢遜酵母的HpSat1p及構巢曲霉中AnSat1p的序列對比，結果顯示這三者之間的同源性高達71%（圖3（a）），同樣的方法比對畢赤酵母的PpCys1p、多型漢遜酵母的HpCys1p以及構巢曲霉的AnCysBp序列比對，結果表明這三者的同源性也高達69.6%的同源性 （圖3（b））。 另外，畢赤酵母中發(fā)現(xiàn)的 PpMet2p和PpMet17p，通過與構巢曲霉及釀酒酵母的Met2p和Met17p對比發(fā)現(xiàn)，其同源性分別高達55.6%和63.2%。

同樣我們還發(fā)現(xiàn)畢赤酵母中存在與轉硫途徑相關的蛋白質序列PpStr3p（同型半胱氨酸合成酶）和PpStr2p（胱硫醚-β-合成酶），以及與逆轉硫途徑相關的PpCys4p（胱硫醚合成酶）及PpCys3p（胱硫醚-β-裂解酶）的同源序列。

這些數(shù)據(jù)說明了在畢赤酵母中可能具有OAH途徑、OAS途徑、轉硫途徑及逆轉硫途徑。

2.2 基因敲除技術及表型分析證明畢赤酵母具有OAS途徑及OAH途徑

圖2 畢赤酵母含硫氨基酸的生物合成途徑Fig.2 Sulfur amino acids synthesize pathway in Pichia pastoris

圖 3 畢赤酵母 PpSat1p（a） 和 PpCys1p（b）與其他酵母和真菌同源蛋白質序列比對Fig.3 Sequence alignments of PpSat1p （a） and PpCys1p（b） with other yeastand filamentous fungal homologs

為了驗證畢赤酵母是否具有OAS途徑及OAH途徑，我們構建了一系列的突變菌株，并在以硫酸銨、甲硫氨酸、半胱氨酸及胱硫醚為惟一硫源的B培養(yǎng)基上驗證生長表型。通過基因敲除技術首先對畢赤酵母Ppcys3敲除，構建Ppcys3Δ單缺陷型菌株。通過與釀酒酵母Sccys3Δ菌株在半胱氨酸缺陷型平板上劃線對比（圖 4（a）），釀酒酵母 Sccys3Δ 菌株在半胱氨酸的缺陷型平板表現(xiàn)出生長致死型[13]，而畢赤酵母Ppcys3Δ則能夠正常生長。這一現(xiàn)象表明，只具有OAH途徑的釀酒酵母由于Sccys3基因敲除，不能合成半胱氨酸導致細胞死亡，而畢赤酵母卻能通過其他途徑合成半胱氨酸來維持細胞生長，這一表型充分證明畢赤酵母中存在OAH途徑（圖1（a））外還有存在另外一條含硫氨基酸的生物合成途徑。

為了驗證這一推論，構建Ppsat1ΔPpmet17Δ及Ppcys1ΔPpmet17Δ雙突變株同時阻斷可能存在的含硫氨基酸合成途徑，并在補充了不同硫源的B培養(yǎng)基上驗證其生長表型。

由圖4（b）可知Ppsat1ΔPpmet17Δ 及Ppcys1ΔPpmet17Δ雙缺陷型突變株在補充2 mmol/L硫酸銨的B培養(yǎng)基上表現(xiàn)出生長致死型，在補充了甲硫氨酸、半胱氨酸或者胱硫醚為硫源的培養(yǎng)基上細胞能夠生長，而Ppsat1Δ、Ppmet17Δ及Ppcys1Δ單缺陷型菌株則能夠與野生型細胞一樣在所有的培養(yǎng)基上維持正常生長。

圖4 畢赤酵母Ppcys3Δ與釀酒酵母Sccys3Δ表型比較Fig.4 Phenotype comparison about Ppcys3Δ and Sccys3Δ

這一生長表型表明，在畢赤酵母中具有OAS途徑，同時也存在OAH途徑。因為根據(jù)序列比對結果表明，PpMet17p是OAH途徑的的關鍵酶，只敲除Ppmet17基因后細胞盡管失去了OAH途徑，但是細胞可通過OAS途徑合成維持細胞生長所需的含硫氨基酸。反之，如果只敲除了Ppsat1或者Ppcys1，細胞只能通過OAH途徑來合成生長所需的含硫氨基酸。只有這樣才能解釋為什么Ppsat1Δ、Ppmet17Δ及Ppcys1Δ三株單缺陷型菌株可以以硫酸銨為惟一硫源維持細胞生長，而 Ppsat1ΔPpmet17Δ及Ppcys1ΔPpmet17Δ雙缺陷型菌株卻表現(xiàn)出生長致死型。

2.3 畢赤酵母轉硫途徑及逆轉硫途徑的驗證

雖然不同的種屬之間存在差異，但在大多數(shù)真菌中都有相似的轉硫途徑或者逆轉硫途徑。1）轉硫途徑：細胞通過OAH途徑合成的同型半胱氨酸在PpCys4p（胱硫醚合成酶）的催化下生成胱硫醚，而后胱硫醚在PpCys3p（胱硫醚-β-裂解酶）的催化下合成半胱氨酸。2）逆轉硫途徑：細胞通過OAS途徑合成的半胱氨酸在PpStr2p（胱硫醚-β-合成酶）的催化下合成胱硫醚，具有同型半胱氨酸合成酶活性的PpStr3p催化胱硫醚合成同型半胱氨酸。

為了證明畢赤酵母是否具有類似轉硫途徑與逆轉硫途徑，作者通過基因敲除Ppstr2、Ppmet17及Ppcys3基因，構建單突變菌株或者雙突變菌株，并在添加了不同有機硫源或無機硫源的B培養(yǎng)基上驗證生長表型，見圖 5。 Ppstr2Δ與 Ppstr2 ΔPpmet17Δ對比，Ppstr2Δ不能在以半胱氨酸的為惟一硫源的平板上生長外，不論是在硫酸銨平板還是甲硫氨酸平板上都能生長。根據(jù)本研究推測的畢赤酵母逆轉硫途徑，PpStr2p是逆轉硫途徑中的關鍵酶，Ppstr2Δ菌株中由于胱硫醚-β-合成酶缺失，導致細胞不能利用半胱氨酸合成胱硫醚，進而不能合成甲硫氨酸，導致細胞死亡。而Ppstr2ΔPpmet17Δ則只能在含甲硫氨酸的B培養(yǎng)基上生長，而在以半胱氨酸或者硫酸銨為硫源的B培養(yǎng)基上細胞不能生長；這說明畢赤酵母細胞中存在逆轉硫途徑，因為敲除Ppmet17基因阻斷了OAH途徑，細胞還能利用OAS途徑合成含硫氨基酸，但是合成的半胱氨酸由于Ppstr2基因被敲除導致胱硫醚-β-合成酶缺失，不能合成甲硫氨酸的前體物質胱硫醚，不能進一步合成甲硫氨酸，所以細胞死亡。

進一步研究Ppcys3Δ、Ppmet17Δ 及 Ppcys3 ΔPpmet17Δ生長表型對比。Ppcys3Δ與 Ppcys3 ΔPpmet17Δ能在硫酸銨及半胱氨酸平板上生長，但是不能在甲硫氨酸平板上生長。這一證據(jù)說明，在畢赤酵母中存在轉硫途徑與逆轉硫途徑，因為Ppcys3Δ與 Ppcys3ΔPpmet17Δ 一樣，當 Ppcys3基因被敲除后，盡管細胞不能利用轉硫途徑合成半胱氨酸，但是細胞仍然可以利用OAS途徑合成半胱氨酸，而后通過逆轉硫途徑合成甲硫氨酸。而Ppcys3ΔPpmet17Δ雙缺陷型菌株，盡管Ppmet17基因被敲除失去了OAH途徑，但是與Ppcys3Δ單缺陷型菌株一樣還有OAS途徑及逆轉硫途徑存在，所以細胞維持正常生長。

圖5 畢赤酵母轉硫途徑與逆轉硫途徑的驗證Fig.5 Validation of transsulfuration pathway and Reverse transsulfuration pathway in P.pastoris

3 結 語

作者根據(jù)遺傳學及表型分析，確定畢赤酵母中存在以同型半胱氨酸為中心的甲硫氨酸和半胱氨酸合成途徑，這與大多數(shù)半子囊酵母菌[14]中含硫氨基酸的生物合成類似。此過程中硫化物中的硫元素首先轉移至三碳化合物生成同型半胱氨酸，然后通過甲基循環(huán)合成甲硫氨酸或者利用轉硫途徑合成半胱氨酸，最終合成GSH等物質[15]。此外在畢赤酵母中同時存在另一條以絲氨酸為底物的半胱氨酸合成途徑，在大多數(shù)絲狀真菌（如構巢曲霉和粗糙脈孢霉）及酵母（如多型漢遜酵母和栗酒裂殖酵母）都存在這條OAS途徑[5-6]。畢赤酵母這種具有OAS途徑及OAH途徑的表達菌株在表達純化硒代蛋白方面具有重要的意義。