馮夢(mèng)茹,周化嵐,張建國

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,食品科學(xué)與工程研究所,上海,200093)

膠原蛋白是動(dòng)物結(jié)締組織中的重要成分,也是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最高的蛋白質(zhì),約占動(dòng)物體蛋白質(zhì)總量的25%～30%[1-3]。因?yàn)槟z原蛋白分子表面具有大量極性側(cè)鏈基,所以膠原蛋白具有較強(qiáng)的吸水性,可結(jié)合10倍于自身質(zhì)量的水,且不溶于水[4]。膠原蛋白可以降低甘油三酯和膽固醇,對(duì)自發(fā)性高血壓有一定的緩解作用[5],同時(shí)增加脂肪的分解并延長(zhǎng)其過程,具有減肥、降血壓和降血脂的作用[6]。此外,膠原蛋白還可以作為乳化劑、穩(wěn)定劑、發(fā)泡劑等改良肉類及其制品、乳制品、飲料的口感[7]?？傊?膠原蛋白作為良好的生物資源廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。

天然膠原蛋白來自畜禽源動(dòng)物組織,具有一定的病毒隱患[8]。此外,天然膠原蛋白提取的方法還存在產(chǎn)量低等不足。利用基因工程可以獲得安全、優(yōu)質(zhì)的重組蛋白,因此研究人員開始以基因工程技術(shù),利用不同宿主細(xì)胞生產(chǎn)膠原蛋白,如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[9-10]、轉(zhuǎn)基因煙草[11]、大腸桿菌[12]、酵母[13]等。20世紀(jì)90年代,日本廣島大學(xué)的吉里勝利教授將人膠原蛋白的基因植入蠶細(xì)胞,獲得人膠原蛋白[10]。培養(yǎng)動(dòng)、植物細(xì)胞的難度大、成本高,而利用重組微生物發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白的技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單,成為熱門研究。范代娣等[14]將人膠原蛋白基因片段轉(zhuǎn)化至大腸桿菌,并通過高密度發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)人膠原蛋白。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)以包涵體形式表達(dá)外源蛋白,致使產(chǎn)物純化困難；同時(shí)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾體系不完善,重組膠原蛋白的生物活性較低。因此酵母等真核微生物表達(dá)膠原蛋白就更加受重視。

畢赤酵母是一種著名的甲基營(yíng)養(yǎng)型蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。它具有基因操作成熟,高密度發(fā)酵,可以對(duì)目的蛋白進(jìn)行類人的糖基化、二硫鍵形成等后修飾[15]。畢赤酵母的分泌表達(dá)模式也有利于重組蛋白的純化[16-17]。本研究利用已構(gòu)建的表達(dá)類人膠原蛋白的重組畢赤酵母菌株,進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化以顯著提高類人膠原蛋白的表達(dá)量,為重組膠原蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和試劑

重組畢赤酵母GS115-Collagen由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏；酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、蛋白marker等試劑,生工生物工程(上海)股份有限公司；YNB,上海源葉生物科技有限公司；其余試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

YPD培養(yǎng)基：1 g酵母粉、2 g蛋白胨、2 g葡萄糖,定容至100 mL,115 ℃滅菌20 min。

BSM培養(yǎng)基：10 mL 100 mmol/L磷酸鹽緩沖液、1.26 g甘油、1.63 g(NH4)2SO4、1.49 g MgSO4·7H2O、0.093 g CaSO4·2H2O,定容至100 mL,121 ℃滅菌15 min,加入0.44 mL PTM1。

PTM1：6 g CuSO4·5H2O、0.088 g KI、3 g MnSO4·H2O、0.2 g Na2MoO4·2H2O、0.02 g H3BO3、0.5 g CoCl2·6H2O、20 g ZnCl2、65 g FeSO4·7H2O、0.2 g 生物素、濃H2SO45 mL,定容至1 L,過濾除菌。

1.2 重組酵母的培養(yǎng)方法

1.2.1 重組畢赤酵母培養(yǎng)方法

取適量甘油保菌管的菌液于YPD培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)24 h,再劃線到Y(jié)PD平板培養(yǎng)基(含有20 g/L瓊脂)30 ℃培養(yǎng)48 h。挑取單菌落至100 mL YPD液體培養(yǎng)基至OD600為2～8,然后,接種到BSM培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。具體培養(yǎng)過程：以4%接種量到BSM培養(yǎng)基在30 ℃條件下培養(yǎng)48 h后,每24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為1.5%的甲醇。培養(yǎng)基優(yōu)化的條件采用BSM+10 g/L酵母粉、BSM+20 g/L蛋白胨、BSM+13.4 g/L YNB、BSM+0.02%生物素(體積分?jǐn)?shù))4種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 甲醇添加量的優(yōu)化

在30 ℃,pH為6.0的條件下,每24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為1%、1.5%、2%、2.5%、3%甲醇。

1.2.3 抑制膠原蛋白水解

為了避免膠原蛋白的水解,分別將BSM培養(yǎng)基(除甘油外)中無機(jī)鹽濃度減少至原來的1/4、1/3、1/2、3/4,再加20 g/L的蛋白胨進(jìn)行培養(yǎng),每24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為1.5%的甲醇。

1.2.4 添加酪蛋白水解物

分別添加5、10、15、20 g/L酪蛋白水解物到培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組畢赤酵母，每24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為1.5%的甲醇。

1.2.5 添加輔助氮源

添加1 g/L尿素、甘氨酸、酪氨酸、L-脯氨酸、谷氨酸、L-羥脯氨酸到培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組畢赤酵母,每24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為1.5%的甲醇。

1.3 分析方法

細(xì)胞濃度采用在600 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度值的方法。蛋白總量的測(cè)定采用Bradford法[18]。膠原蛋白含量的測(cè)定采用離心發(fā)酵液后取上清,進(jìn)行三氯乙酸濃縮處理[19](濃縮25倍),對(duì)濃縮的膠原蛋白進(jìn)行SDS-PAGE定性檢測(cè)[20],分析膠原蛋白條帶灰度后得出膠原蛋白分泌量。本研究所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加復(fù)合成分對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)及分泌類人膠原蛋白的影響

前期研究表明,本重組畢赤酵母在BMGY培養(yǎng)基中可以分泌表達(dá)類人膠原蛋白,不能在BSM培養(yǎng)基中分泌表達(dá)類人膠原蛋白。向BSM中添加復(fù)合成分使重組畢赤酵母表達(dá)類人膠原蛋白的結(jié)果見圖1。向BSM培養(yǎng)基中分別添加蛋白胨、酵母粉、YNB等復(fù)合成分后重組畢赤酵母的細(xì)胞濃度明顯高于添加生物素的細(xì)胞濃度,但是分別添加蛋白胨、酵母粉、YNB條件下的畢赤酵母細(xì)胞濃度之間差別不顯著(圖1-a)。對(duì)重組畢赤酵母發(fā)酵上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)可知,添加20 g/L蛋白胨使重組畢赤酵母明顯表達(dá)類人膠原蛋白(圖1-b)。所以下述實(shí)驗(yàn)的重組畢赤酵母培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)基于BSM+20 g/L蛋白胨展開。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量；1～3：BSM+10 g/L酵母粉； 4～6：BSM+20 g/L蛋白胨；7～8：BSM+YNB；9～10：BSM+生物素 a-細(xì)胞濃度;b-誘導(dǎo)120 h時(shí)發(fā)酵上清液的SDS-PAGE電泳圖圖1 添加復(fù)合成分對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和類人 膠原蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of complex constituents addition on recombinant K.phaffii growth and collagen expression

2.2 甲醇添加量對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)及表達(dá)類人膠原蛋白的影響

每24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為1%、1.5%、2%、2.5%、3%的甲醇誘導(dǎo)膠原蛋白表達(dá)。當(dāng)補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為1.5%甲醇時(shí),重組畢赤酵母的細(xì)胞濃度最佳(圖2-a),類人膠原蛋白的分泌量也有最佳值,為18.87 mg/L(圖2-b)。SDS-PAGE表明,每24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為2%甲醇時(shí),類人膠原蛋白出現(xiàn)明顯降解。每24 h添加體積分?jǐn)?shù)為3%甲醇時(shí),電泳圖中類人膠原蛋白的條帶不明顯(圖2-c)。因此,高濃度的甲醇添加量不利于重組畢赤酵母分泌表達(dá)類人膠原蛋白。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量；1～3-1%甲醇誘導(dǎo)；4～6-1.5%甲醇誘導(dǎo)；7～8-2%甲醇誘導(dǎo)；9～11-2.5%甲醇誘導(dǎo)；12～14-3%甲醇誘導(dǎo)。 a-細(xì)胞濃度;b-誘導(dǎo)120 h的類人膠原蛋白分泌量;c-誘導(dǎo)120 h時(shí)發(fā)酵上清液的SDS-PAGE電泳圖圖2 甲醇添加量對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和類人膠原蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of methanol addition on recombinant K.phaffii growth and collagen expression

2.3 避免類人膠原蛋白的降解

為避免分泌后的類人膠原蛋白在發(fā)酵液中被水解,本研究通過減少BSM培養(yǎng)基中無機(jī)鹽含量,研究其對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和分泌類人膠原蛋白的影響。圖3-a表明重組畢赤酵母的細(xì)胞濃度隨著無機(jī)鹽濃度的減少而降低。但是誘導(dǎo)120 h,重組畢赤酵母在不同稀釋程度的BSM(終濃度20 g/L蛋白胨)的細(xì)胞濃度差別不顯著(圖3-a)。誘導(dǎo)96 h后,類人膠原蛋白的分泌量在1/4 BSM培養(yǎng)基中最高。誘導(dǎo)120 h時(shí),類人膠原蛋白在1/4 BSM培養(yǎng)基出現(xiàn)顯著降解,在1/3 BSM發(fā)酵液中類人膠原蛋白量為18.49 mg/L,降解不顯著(圖3-b,3-c)。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量；1～3-1/4BSM；4～6-1/3BSM；7～8-1/2BSM；9～10-3/4BSM a-細(xì)胞濃度;b-誘導(dǎo)96 h的類人膠原蛋白分泌量;c-誘導(dǎo)120 h的類人膠原蛋白分泌量;d-誘導(dǎo)96 h時(shí)發(fā)酵上清液的 SDS-PAGE電泳圖;e-誘導(dǎo)120 h時(shí)發(fā)酵上清液的SDS-PAGE電泳圖圖3 稀釋BSM培養(yǎng)基對(duì)重組酵母生長(zhǎng)和類人膠原蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of BSM dilution on recombinant K.phaffii growth and collagen expression

圖3-d、3-e為誘導(dǎo)96、120 h時(shí)發(fā)酵液上清液的SDS-PAGE圖。類人膠原蛋白表達(dá)量在稀釋BSM后雜蛋白顯著減少。這說明稀釋BSM培養(yǎng)基有利于類人膠原蛋白的表達(dá)及其純化。綜合以上考慮,后續(xù)研究以1/3 BSM+20 g/L蛋白胨為培養(yǎng)基繼續(xù)研究。

2.4 添加酪蛋白水解物對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)及表達(dá)類人膠原蛋白的影響

添加酪蛋白水解物促進(jìn)重組畢赤酵母生長(zhǎng),誘導(dǎo)120 h后細(xì)胞濃度達(dá)到15.22(OD600),比基礎(chǔ)培養(yǎng)基增加了約19.70%(圖4-a)。誘導(dǎo)96 h時(shí),添加質(zhì)量濃度為20 g/L酪蛋白水解物時(shí)類人膠原蛋白的分泌量達(dá)35.85 mg/L,增加了約90%(圖4-b)。誘導(dǎo)120 h時(shí)類人膠原蛋白的量仍出現(xiàn)下降(圖4-c,4-d),說明仍有類人膠原蛋白降解的現(xiàn)象。這可能由于高濃度酪蛋白水解物不利于類人膠原蛋白在細(xì)胞器(例如高爾基體)中正確折疊。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；1～2-5 g/L酪蛋白；3～4-10 g/L酪蛋白；5～6-15 g/L酪蛋白；7～8-2 g/L酪蛋白；9-5 g/L酪蛋白； 10-10 g/L酪蛋白；11-15 g/L酪蛋白；12-20 g/L酪蛋白 a-酪蛋白對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)的影響;b-誘導(dǎo)96 h的類人膠原蛋白;c-誘導(dǎo)120 h的類人膠原蛋白; d-誘導(dǎo)120 h時(shí)發(fā)酵上清液的SDS-PAGE電泳圖圖4 添加酪蛋白對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和類人膠原蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of casein addition on recombinant K.phaffii growth and collagen expression

2.5 添加氮源對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)及表達(dá)類人膠原蛋白的影響

氮源是生物體合成蛋白質(zhì)的重要原料。在1/3 BSM+20 g/L蛋白胨培養(yǎng)基中添加6種氮源后的結(jié)果見圖5。分別添加甘氨酸、L-脯氨酸和谷氨酸將細(xì)胞濃度提高了10%～15%(圖5-a)。氮源的添加也可以提高重組畢赤酵母分泌蛋白總量。其中甘氨酸、尿素、L-脯氨酸的添加將蛋白總量提高了52.8%(部分?jǐn)?shù)據(jù)列于表1)。

表1 不同氮源種類對(duì)蛋白總量和類人膠原蛋白表達(dá)量的影響Table 1 Effects of nitrogen sources on protein and collagen expression

氮源的添加顯著提高類人膠原蛋白的表達(dá)量,同時(shí)顯著地減少了雜蛋白的分泌量(圖5-b、5-c)。其中L-脯氨酸使類人膠原蛋白的分泌量增加到40.26 mg/L(圖5-b)。經(jīng)誘導(dǎo)120 h后,添加L-脯氨酸的培養(yǎng)基中重組畢赤酵母分泌的類人膠原蛋白量最高,且無明顯降解現(xiàn)象(圖5-c)。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量；1～2-甘氨酸；3～5-尿素；6～8-酪氨酸；9～10-4-羥基-L脯氨酸；11～13-谷氨酸；14～16-L-脯氨酸 a-細(xì)胞濃度;b-誘導(dǎo)120 h的類人膠原蛋白;c-誘導(dǎo)120 h時(shí)發(fā)酵上清液的SDS-PAGE電泳圖圖5 不同氮源對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和類人膠原蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of nitrogen sources on recombinant K.phaffii growth and collagen expression

3 結(jié)論

本文從培養(yǎng)基成分、甲醇添加劑量及最佳營(yíng)養(yǎng)物的添加量等方面優(yōu)化了重組畢赤酵母分泌表達(dá)類人膠原蛋白表達(dá)條件。通過稀釋BSM至1/3,添加20 g/L蛋白胨,添加1 g/L的L-脯氨酸為輔助氮源,以1.5%的甲醇作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo),可將類人膠原蛋白的分泌量提高到40.26 mg/L,比優(yōu)化前的分泌量提高2.13倍。本研究通過減少培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的含量抑制了類人膠原蛋白的水解,降低了生產(chǎn)成本。通過添加氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),提高類人膠原蛋白的表達(dá)量,其中L-脯氨酸的添加,顯著提高了類人膠原蛋白的分泌量。綜上所述,添加合適的氮源更有利于重組畢赤酵母菌株分泌類人膠原蛋白,同時(shí)還能減少雜蛋白的生成。本研究結(jié)果為膠原蛋白的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。